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近年来畜禽传染病严重危害畜牧产业的健康发展,尤其是病毒性传染病,迄今,疫苗预防是对其控制最重要的措施。许多疫苗依赖佐剂来增强抗原的免疫抗原性或改变宿主的保护性应答类型。佐剂是先于抗原或与抗原同时应用时能增强抗原物质免疫原性,增强机体免疫应答,或改变机体免疫应答类型的物质,单独使用时一般无免疫原性。佐剂在免疫中的作用主要是提升机体免疫系统对抗原的免疫应答反应,包括增强免疫反应强度和反应的持久性。近年来,研究发现植物多糖具有免疫佐剂的作用,能够增强疫苗的免疫效果,促进机体特异性免疫与非特异性免疫、细胞免疫与体液免疫。植物多糖类佐剂具有天然、低毒、无药物残留等优点,在使用安全性方面具有优势。但目前能够应用于生产实践中的植物多糖类佐剂不多,寻找一种资源丰富的植物多糖类佐剂以满足生产实践需要迫在眉睫。车前草是车前草科植物,广布全世界,有三属约270种,在我国仅有车前属,共18种。车前草在我国分布极广,是一味传统中药,具有清热、凉血、解毒、利尿等功效。现代药理学的研究表明,车前草含有丰富的生物活性成分,如多糖类、黄酮类、熊果酸及苷类等。多糖是车前草发挥生物活性的主要物质。Berit等(1995)对车前草中具有生物活性的多糖进行分离,并探明其部分结构特征发现,有L-阿拉伯糖(20%),D-半乳糖(28%),D-葡萄糖(6%),D-甘露糖(2%),L-鼠李糖(4%),D-葡萄糖酸(31%)及少量D-木糖和炭藻糖,主要以B-1,4连接为主链,2和3位含侧链。目前关于车前草多糖作为免疫增强剂的研究显有报道。本课题采用车前草多糖作为新城疫疫苗佐剂,研究车前草多糖的免疫增强作用。1.车前草多糖提取纯化工艺及生物学活性的研究采用超声辅助提取法提取车前草多糖,根据单因素试验,筛选出影响多糖提取的因素及水平,通过均匀设计方法进行因素及水平的优化,确定最佳提取工艺为：超声时间60min、温度60摄氏度、料液比1：30,提取率为75.88mg/g。对提取的车前草粗制多糖进行纯化,采用三氯乙酸法脱蛋白,脱蛋白率为52.1%,采用活性炭脱色,脱色率为82.3%。对车前草理化性质的分析：车前草多糖为黄褐色粉末状物质；可溶于水、稀酸、稀碱；不溶于乙醇、石油醚、丙酮、正丁醇等有机溶剂；含有还原糖：不含淀粉、单糖和二糖;车前草多糖溶液PH为7.8。车前草多糖具有体外清除自由基的作用,车前草多糖浓度70μg/ml时对·OH~的清除率为41.1%：浓度为125μg/ml时对O2~·清除率为37.2%;浓度为160μg/mll时对NO2’·清除率为72.5%。2.车前草多糖对雏鸡生长增重、生理生化指标及免疫器官指数的影响用车前草多糖溶液连续6天饲喂雏鸡,对照组饲喂等量生理盐水,并于给药后第5(D5)、10 (D10)、15 (D15)、20 (D20)、28 (D28)天,采样进行生长增重、血常规、生理生化指标、免疫器官脏器指数测定及免疫器官组织学观察。结果显示：随着日龄增加,在D10、D15、D20、D28天,车前草多糖组雏鸡体重分别为214.35g、359.71g、633.44g、826.52g极显著的高于空白对照组；在给药后第D 5-D15天车前草多糖组RBC(1.84～2.45×1012/L)显著高于空白组RBC(1.40-2.14x1012/L),(P<0.05)；在给药后第D28天车前草多糖组WBC(258.8×109/L)显著高于空白组BC (128.1×109/L), (P<0.05);在给药后第D10～D28天,车前草多糖组GOT(131.9～27.57IU/L) 和 GPT (8.53～16.99IU/L)显著或极显著地高于空白对照组GOT(27.2-19.67IU/L)和GPT (2.58～5.87IU/L), (P<0.05, P＜0.01);在D5-D28天车前草多糖组AKP(10.47～10.15IU/L)和PCa (1.59～1.01 mmol/ml)与空白对照组AKP (7.54～3.4IU /L)和PCa(1.31～1.07 mmol/ml)差异不显著：在D5-D28天车前草多糖组胸腺指数(2.04：-0.28-2.93-0.23)、脾脏指数(1.2±0.14～1.90±0.12)与法氏囊指数(4.11±0.46～5.98±0.25)显著或极显著地高于空白对照组胸腺指数(1.38±0.24-2.40±0.31)、脾脏指数(1.06+0.32～1.52±0.28)与法氏囊指数(2.54±0.77～4.47±0.29),(P<0.05,P<0.01)；观察脾脏组织切片时发现,给药后D5-D20天,车前草多糖组的雏鸡脾脏红髓淋巴细胞、浆细胞和巨噬细胞均较对照组多;观察胸腺组织切片时发现,给药后D10～D20天,车前草多糖组的胸腺小叶面积均大于对照组；观察法氏囊组织切片时发现,给药后D10-D28天时车前草多糖组的腔上囊小节显著大于对照组。以上结果证明车前草多糖能够促进雏鸡生长增重,促进器官发育及提高免疫水平。3.车前草多糖对新城疫疫苗免疫效果的影响将320羽1日龄雏鸡随机分为7组,即：鸡新城疫(ND)疫苗免疫组、ND疫苗+车前草多糖(5Cmg/ml)组、ND疫苗+车前草多糖(25mg/ml)组、ND疫苗+车前草多糖(12.5mg/ml)组,同时设立ND疫苗+黄芪多糖(1.5g/m1)组、ND疫苗+地塞米松(2.5mg/ml)组和健康组为对照,于首次注射后第7(D7)、14 (D14)、21(D21)、35 (D35)天,每组随机抽取雏鸡采样,测定脏器指数、血凝抑制抗体效价、外周血T淋巴细胞增殖率及外周血T淋巴细胞CD4+/CD8+的比值。脏器指数的结果显示：车前草多糖50m-ml剂量组胸腺指数(6.45±0.24～3.07±0.17)、脾脏指数(3.12±0.11～2.05±0.11)与法氏囊指数(7.66±0.093～3.31±0.13)及黄芪多糖组胸腺指数(6.07±0.56～3.24±0.22)、脾脏指数(3.31±0.42～2.11±0.16)与法氏囊指数(8.06±0.09～3.45±0.16)显著或极显著的高于ND免疫组胸腺指数(4.23±0.13～2.77±0.12)、脾脏指数(2.28±0.11～1.83±0.12)与法氏囊指数(5.86±0.45～2.97±0.12),(P<0.05,P<0.01)。抗体效价的结果显示：车前草多糖50mg/ml (11.25～9.50)、25mg/ml(10.25～8.75)、12.5mg/ml(10.00～8.50)剂量组及黄芪多糖组(11.25～9.50)在D14～D28极显著的高于ND免疫组(8.75～6.75),(P<0.01)；地塞米松组(5.33～5.00)在D14～D35极显著的低于ND免疫组(8.75～6.75),(P<0.01)。淋巴细胞转化率的结果显示：车前草50mg/ml剂量组(2.1733±0.042～2.0623±0.061)及黄芪多糖组(2.0678±0.059～2.0267±0.099)在D7～D28天,T淋巴细胞转化率均极显著的高于ND疫苗组(1.8967±0.031-1.7213±0.084),(P<0.01)；地塞米松组(1.5633±0.045-1.5723±0.045)在D7～D21极显著的低于ND免疫组(1.8967±0.031-1.7213±0.084),(P<0.01)。CD4+/CD8+比值的结果显示：车前草多糖50mg/ml剂量组(1.9186±0.035-1.8013±0.028)在D7-D35天CD4+/CD8+的比值极显著或显著的高于ND疫苗组(1.6417±0.02～1.3507±0026),(P<0.01,P<0.05)；车前草多糖25mg/ml(2.0347±0.035-1.7573±0.028)、12.5mg/ml剂量组(2.070±0.061～1.7487±0.02)和黄芪多糖组(2.0263±0.043-1.7620±0.03)在D14～D35天CD4+/CD8+的比值极显著高或显著高于ND疫苗组(1.5867±0.04-1.3507±0026),(P<0.01,P<0.05)；：车前草多糖50mg/n-剂量组(1.9186±0.035～2.0697±0.036)在D7～D21天CD4+/CD8+的比值显著的高于黄芪多糖组(1.7710±0.006～1.7593±0.05),(P<0.05)；地塞米松组在D7～D35天显著的低于ND疫苗组(1.6417±0.02～1.3507±0026),(P<0.01)。以上结果证明车前草多糖能够提高ND疫苗的免疫效果。