研究背景：近年来，全球糖尿病的发病率、死亡率明显上升，已成为威胁人类健康与寿命的最重要疾病之一。糖尿病（DiabetesMellitus）是由遗传和环境等因素引起胰岛素绝对或相对不足，导致糖、脂肪、蛋白质代谢异常，而以慢性高血糖为主要表现的一组临床综合征。除引起糖脂代谢的紊乱外，糖尿病可引起心、肾、脑等多个器官的合并症，其中以心脏并发症最为危险，是导致糖尿病人死亡的最主要原因。本实验室前期的研究显示，无论是高糖高脂喂养结合链脲佐菌素注射造成的慢性2型糖尿病大鼠模型，还是高糖高脂刺激的培养心肌细胞，均观察到明显的心肌细胞损伤和凋亡，其机制与高糖高脂刺激引起硫氧还蛋白(thioredoxin,Trx)的活性下降有关，而硫氧还蛋白相互作用蛋白(thioredoxin interacting protein,TXNIP)的表达明显上调，是糖尿病引起Trx功能下降的重要原因。TXNIP是目前发现的唯一一种内源性的Trx结合抑制蛋白，在肿瘤、糖尿病等疾病中发挥作用。本实验室之前在高糖高脂喂养结合小剂量链脲佐菌素注射制备的2型糖尿病模型和高糖高脂刺激的培养成鼠心肌细胞上都发现了TXNIP表达的显著增加，而且是糖尿病时Trx系统相关各蛋白中变化最明显的一个，同时观察到糖尿病或高糖高脂刺激引起了心肌细胞的损伤和凋亡。但是TXNIP的上调仅仅是糖尿病时一种继发的伴随性变化，还是本身参与了糖尿病细胞损伤的发生，尚不清楚。为分析此问题，我们前期构建了TXNIP的干扰质粒并转染培养的H9C2细胞，观察抑制高糖高脂引起的TXNIP表达，是否可以减轻心肌细胞的损伤和凋亡。结果表明，使用RNA干扰技术减弱TXNIP的上调后，高糖高脂刺激引起的心肌细胞损伤和细胞凋亡减轻，Trx的活性显著提高，可以证明TXNIP的上调是糖尿病引起心肌细胞损伤的重要环节。考虑到前述研究均是在糖尿病或模拟条件下的观察，研究TXNIP的作用时仍不能排除高糖高脂的直接或TXNIP以外的损伤途径，因此，为进一步明确TXNIP的表达升高本身是否足以引起心肌细胞损伤的发生设计了本实验，采用腺病毒转染培养的H9C2细胞，使心肌细胞过表达TXNIP，观察单纯TXNIP增多对正常糖脂培养条件下心肌细胞损伤和凋亡的影响，并对其损伤机制进行了简要分析。目的：运用病毒转染技术，使心肌细胞过表达TXNIP，以观察正常培养条件下细胞单纯过表达TXNIP是否可以引起心肌细胞凋亡，并对其机制进行分析，以明确TXNIP在糖尿病心肌细胞凋亡中的作用及其途径。方法：1.使用腺病毒转染技术使心肌细胞过表达TXNIP使用处在对数生长期的H9C2细胞，细胞随机分为3组，即：正常培养组、不含目的基因的腺病毒对照组（Ad-eGFP组）、TXNIP过表达（Ad-TXNIP-eGFP）组；在转染前一天分别换液处理，第二天进行转染，病毒滴度按每个细胞100个病毒颗粒计算。4h后补加含10%胎牛血清的DMEM继续培养，24h后换液处理，继续培养至72h，中间观察病毒转染效率。2.确定转染效率利用荧光倒置显微镜拍摄同一个视野下的转染细胞，计算同一个视野下带绿色荧光蛋白细胞占整个视野下所有细胞的百分比计算转染效率。同时使用Real-timePCR方法测定转染H9C2心肌细胞TXNIP的mRNA表达。3.分析TXNIP在心肌细胞损伤和凋亡中的作用通过前两部分实验，确定转染率相对最高的时间点，分别收集各组培养细胞核培养基，测定乳酸脱氢酶（LDH）活性、丙二醛（MDA）和3-硝基酪氨酸含量、p38激酶、caspase-3及Trx活性,并用流式细胞术检测细胞凋亡率，用westernblot方法分别测TXNIP和Trx蛋白的表达量。结果：1.转染效率1.1荧光显微镜观察转染效率镜下观察转染成功，24h、48h、72h转染效率分别为：9.94％±1.12％、68.50％±4.57％、88.86％±3.23％，其中转染72h的转染效率显著高于转染24h(P<0.01)和转染48h(P<0.01)，因此该部分实验我们选择转染72h的细胞做后续实验分析（图1）。1.2Real-timePCR方法测定转染H9C2心肌细胞TXNIP的mRNA表达与正常培养组相比，Ad-eGFP组细胞TXNIP的mRNA无显著性变化（mRNA0.99±0.13vs.1.08±0.26;P>0.05），TXNIP过表达组与Ad-eGFP组相比：TXNIP的mRNA水平显著升高（mRNA1.24±0.28vs.1.08±0.26;P<0.05），说明构建载体、病毒包装、细胞转染、过表达目的基因成功（图2A,2B）。1.3WesternBlot方法测定转染成功后TXNIP表达增高、Trx蛋白表达未见明显改变如图3所示：Ad-eGFP组与正常对照相比TXNIP蛋白表达无显著改变（0.98±0.06vs.1.03±0.14；P>0.05），而与Ad-eGFP组相比，Ad-TXNIP-eGFP的TXNIP过表达组TXNIP蛋白水平明显升高(1.21±0.09vs.1.03±0.14；P<0.01)，同时测定发现Trx蛋白表达没有显著性的变化(1.14±0.09vs.1.09±0.05；P>0.05)，说明TXNIP表达增高对Trx的蛋白表达无明显影响（见图4）。1.4Trx活性测定如图5所示：与正常培养组相比，Ad-eGFP组细胞Trx活性无显著性变化（0.14±0.03vs.0.13±0.01;P>0.01），与Ad-eGFP组相比，TXNIP过表达组Trx活性明显降低（0.02±0.05vs.0.13±0.01;P<0.01），提示TXNIP的过表达不会引起Trx的蛋白表达量的改变但是会明显的抑制Trx的活性。1.5乳酸脱氢酶（LDH）活性的变化如图6所示：与正常培养组相比，Ad-eGFP组LDH活性没有显著性的差异（1344.53±127.12U/Lvs.1367.30±118.88U/L;P>0.05）；而与Ad-eGFP组相比，Ad-TXNIP-eGFP组LDH活性显著升高(1528.20±117.80U/Lvs.1367.30±118.88U/L;P<0.01)，提示TXNIP表达增高可引起心肌细胞损伤。1.6MDA生成测定MDA是常用的反映膜脂质过氧化损伤程度的指标。本实验中，与正常培养组相比，Ad-eGFP组MDA含量无显著差别（14.65±2.14μMvs.13.14±2.36μM；P>0.01）；与Ad-eGFP组相比，Ad-TXNIP-eGFP组MDA生成显著升高(17.92±0.91μMvs.13.14±2.36μM；P<0.01)（图7），提示TXNIP过表达引起氧化应激增加，自由基损伤加重。1.73-硝基酪氨酸含量测定3-硝基酪氨酸是蛋白质被过氧化亚硝酸自由基（ONOO-）硝基化修饰的产物，常作为反映过氧化亚硝酸自由基生成量及蛋白硝基化水平的指标。如图8所示，与正常培养组相比，Ad-eGFP组3-硝基酪氨酸生成无显著性变化（1.28±0.35μg/mLvs.1.15±0.27μg/mL;P>0.01）；与Ad-eGFP组相比，TXNIP过表达组3-硝基酪氨酸生成显著增加（1.63±0.56μg/mLvs.1.15±0.27μg/mL;P<0.01），提示TXNIP明显的增加了过氧化亚硝酸自由基及其损伤的发生。1.8caspase-3活性测定caspase-3的激活是细胞凋亡发生的主要途径，如图9所示，与正常培养组相比，Ad-eGFP组caspase-3活性无显著性变化（0.29±0.22nmol/h/mgprovs.0.68±0.31nmol/h/mgpro；P>0.05），而Ad-TXNIP-eGFP组与Ad-eGFP组相比，caspase-3活性明显增高（1.79±0.53nmol/h/mgprovs.0.68±0.31nmol/h/mgpro；P<0.05），提示TXNIP过表达引起明显的心肌细胞的凋亡发生。1.9p38激酶活性p38激酶是介导氧应激损伤、激活caspase依赖凋亡途径的重要激酶。如图10所示，与正常培养组相比，Ad-eGFP组p38激酶活性无明显改变（1.08±0.05vs.1.07±0.04；P>0.05），而Ad-TXNIP-eGFP组与Ad-eGFP组相比，p38激酶活性显著升高(1.26±0.06vs.1.07±0.04；P<0.05)。1.10流式细胞仪测凋亡如图11所示，正常培养组与不含TXNIP的Ad-eGFP组间细胞凋亡率无显著差异(1.72±0.61vs2.01±0.91;P>0.01)；TXNIP过表达组与不含TXNIP的Ad-eGFP组相比，细胞凋亡率明显增加(6.87±4.22vs2.01±0.91;P<0.01)。结论：在H9C2心肌细胞上单纯过表达TXNIP可以通过抑制Trx的活性，增加自由基损伤和激活p38激酶，从而引起正常糖脂浓度培养条件下的心肌细胞发生损伤和凋亡。