论文部分内容阅读
目的：通过制作良性胆管狭窄(benign biliary stricture,BBS)兔动物模型,获得胆管良性狭窄标本并体外分离和培养良性狭窄胆管成纤维细胞。通过内毒素(lipopolysaccharide,LPS)刺激实验,观察LPS对体外培养的兔良性狭窄胆管组织中成纤维细胞的形态,增殖活性,Ⅰ、Ⅲ型胶原分泌和转化生长因子-β(Transforming growth factor,TGF-β1)、干扰素-γ(Interferon-γ, IFN-γ)分泌的影响,探讨LPS在早期胆管瘢痕愈合中的影响和其可能的作用机制。方法：通过钳夹法建立新西兰大白兔胆管良性狭窄动物模型,造模后7天取出病变胆管,应用胰蛋白酶消化法联合组织块法分离培养胆管成纤维细胞,用含10%胎牛血清的改良培养基(Dulbecco modified Eagle medium,DMEM)进行培养并传代。倒置显微镜下观察成纤维细胞形态。选用第3-5代胆管成纤维细胞随机分为对照组和内毒素刺激组,应用四甲基偶氮唑盐(Methylthiazolyl tetrazolium,MTT)法检测不同浓度(0.05μg/ml,0.10μg/ml,0.25μg/ml,0.50μg/ml, 1.00μg/ml,2.00μg/ml)LPS溶液对兔胆管成纤维细胞增殖和活力的影响；应用酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测不同浓度内毒素作用后成纤维细胞Ⅰ型、Ⅲ型胶原分泌的变化。除了上述指标以外,还采用ELISA法检测成纤维细胞培养上清液中TGF-β1、IFN-γ的含量,探讨LPS对成纤维细胞可能具有的作用机制。结果：(1)钳夹后的胆总管肉眼可见充血、水肿,术后7天再开腹取标本时可见胆管周围组织有比较明显的粘连。肝脏可见轻度淤胆表现。粘连组织疏松,容易分离,分离粘连后见胆管仍有淤血和肿胀,近端胆管扩张。(2)在倒置显微镜下观察体外培养的细胞呈长梭形、多角形或不规则形,细胞质透明；细胞核大,椭圆形,颜色淡。每个细胞通常含2-3个核。(3)LPS浓度在0.05-0.50μg/ml时,促进成纤维细胞增殖和Ⅰ、Ⅲ型胶原合成(P<0.05),在浓度为0.100μg/ml时促进作用最为明显,LPS刺激浓度为1.000μg/ml时则抑制成纤维细胞的增殖和Ⅰ、Ⅲ型胶原合成(P<0.05)(4)LPS刺激并传代后各时间点成纤维细胞TGF-β1的分泌增加、同时IFN-γ的分泌减少。结论：(1)兔胆总管钳夹法可以作为一种获取良性狭窄胆管成纤维细胞的方法。(2)胰蛋白酶消化法联合组织块法分离培养兔胆管成纤维细胞是一种较好的细胞培养方法。(3)在一定浓度的LPS刺激后对成纤维细胞的分裂和增殖等生物学特性有促进作用,浓度达到峰值后开始出现抑制。表明在一定的浓度的LPS存在时可能促进胆管损伤的修复,但是过度修复会造成胆管良性狭窄；过高的浓度可能会延迟甚至阻碍胆管损伤的修复。(4)LPS对良性狭窄胆管成纤维细胞作用机制可能与促进TGF-β1的分泌和抑制IFN-γ分泌有关。