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半纤维素是自然界中第二大可再生资源,人们对其组分最丰富的木聚糖的降解研究及其生物转化技术探索方兴未艾。在木聚糖降解酶系中内切木聚糖酶和p-木糖苷酶都是非常重要的糖苷水解酶。p-木糖苷酶已经应用于传统工业工艺中。在养殖业,β-木糖苷酶可以改善饲料的营养价值提高肉类的品质。在食品工业,木糖苷酶一般用作浸渍酶,主要应用于萃取和澄清果汁,提高品质。在酿造工业,p-木糖苷酶可以降低啤酒和葡萄汁的粘稠度和浑浊度,提高过滤后的澄清度,提高酒的稳定性和香醇性。在造纸工业,p-木糖苷酶可以减少化学品的消耗。木糖苷酶与其它半纤维素酶一起具有很多潜在的应用包括咖啡工艺,蔬菜浸渍,高纤维烘焙材料与颜料的制备,调味品,淀粉抽提,清洁剂工业以及抗菌和抗氧化的多糖活性药物等。本文分别从深海嗜热细菌嗜热脂肪芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)和真菌烟曲霉(Aspergillus fumigatus)中克隆了p-木糖苷酶(β-xylosidase)基因,并在大肠杆菌DE3中表达、纯化和研究其酶学性质。研究结果如下。1.来自嗜热脂肪芽孢杆菌的β-木糖苷酶(gsxyn)基因全长2118bp,起始密码子为ATG,终止子为TAA, GC含量为51.37%。gsxyn编码705个氨基酸,等电点pI为5.03,分子量为79.82kDa。通过SignalP4.1Server预测氨基酸序列没有信号肽。通过BLAST比对,GSxyn属于第52家族糖苷水解酶,催化氨基酸残基为Glu-335和Asp-495。将gsxyn基因克隆到表达载体pGEX-6p-1上,在大肠杆菌DE3中表达,然后纯化和分析木糖苷酶的酶学性质。GSxyn在pH5.5和70℃时酶活最高；在以对硝基苯-β-D-吡喃木糖苷(pNPX)作为底物时, GSxyn的Km为0.48mM,Vmax为27.54μmol/mg-min,Kcat为36.63s-1和Kcat/Km为76.99L/s-mm。为了探索木糖苷酶的底物特异性,研究多功能酶结构特点,通过木糖苷酶的定点突变(Y509E)引入了木聚糖酶的活性,并保持有原始的木糖苷酶活性。通过高效液相阴离子交换色谱层析(HPAEC)测定引入的木聚糖酶是水解酶。在这过程中分别研究了在突变之后木糖苷酶和木聚糖的酶学性质。突变体Y509E的木糖苷酶(Y509Exyn)活性：Y509Exyn在pH5.5和60℃时酶活最高；在以对硝基苯-p-D-吡喃木糖苷(pNPX)作为底物时,Y509Exyn的Km为0.51mM,Vmax为15.52μmol/mg-min,Kcat为20.64s-1和kcat/Km为40.75L/s-mmol。突变体Y509E的木聚糖酶(Y509Exy1)活性：Y509Exy1在pH6.5和50℃时酶活最高；在以山毛榉木聚糖作为底物时,Y509Exy1的Km为5.10mg/mL, Vmax为16.94μmol/mg-min, kcat为22.53s-1和kcat/Km为4.42mL/s-mg。因此,这部分实验结果证明第52家族木糖苷酶可以为一般构建具有多催化功能的酶,特别是能够降解工业上重要的复杂的物质(如植物细胞壁)的糖苷水解酶,提供一个研究的平台。2.来自烟曲霉的β-木糖苷酶(afc6xyn)基因全长1595bp,在第六染色体上,包含有一个内含子。afc6xyn基因的ORF为1542bp,起始密码子为ATG,终止子为TAA, GC含量为51.62%。afc6xyn编码513个氨基酸,等电点pI为5.60,分子量为57.36kDa。通过SignalP4.1Server预测氨基酸序列没有信号肽。通过BLAST比对,Afc6xyn属于第43家族糖苷水解酶,催化氨基酸残基为Asp-140和Glu-194。将afc6xyn基因克隆到表达载体pGEX-6p-1上,在大肠杆菌DE3中表达,然后纯化和分析木糖苷酶酶学性质.Afc6xyn在pH6.0和50℃时酶活最高；在以对硝基苯-β-D-吡喃木糖苷(pNPX)作为底物时,Afc6xyn的Km为0.56mM,Vmax为0.25μmol/mg-min,kcat为0.24s-1和kcat/Km为0.42L/s-mmol。这是第一次报道从烟曲霉中克隆表达第43家族的木糖苷酶。