恶性肿瘤是严重威胁人类生命健康的重大疾病之一,安全有效的治疗恶性肿瘤是目前全球亟待解决的医疗问题和社会问题。随着生命科学和医学研究的深入发展,生物治疗已成为继手术、放疗和化疗之后的第四大类肿瘤治疗手段。以腺病毒为载体的基因治疗是目前恶性肿瘤生物治疗的一个重要发展方向。此外,溶瘤腺病毒由于具有感染宿主广、安全易生产、可插入较大外源基因等优点也受到广泛的研究和应用。而结合基因治疗和溶瘤病毒治疗的双重优势,以溶瘤腺病毒为载体介导的基因治疗是一种十分具有应用前景的恶性肿瘤治疗策略。然而,随着腺病毒载体临床研究的不断深入,人们逐渐发现腺病毒载体进一步应用于人体仍然存在诸多限制。例如:人体广泛存在的预存免疫会造成转基因效率下降甚至存在安全风险、静脉给药时易在肝脏富集、特异性和抗肿瘤活性还有待进一步提高等。本论文通过选择合适的特异性肿瘤治疗基因,同时利用分子生物学技术对溶瘤腺病毒衣壳蛋白进行基因修饰,希望得具有靶向性、安全性以及更强抗肿瘤活性的新型溶瘤腺病毒基因治疗载体,为腺病毒载体的进一步人体临床应用和恶性肿瘤基因治疗新策略的研究提供基础。目前对腺病毒进行基因修饰的靶点主要集中在3种主要衣壳蛋白:纤维蛋白（fiber）、五邻体基底（penton）、六邻体（hexon）,以及次要衣壳蛋白pⅨ上。由于病毒的结构蛋白对于病毒衣壳的稳定性以及病毒的装配具有重要作用,对纤维蛋白等主要衣壳蛋白的基因修饰往往会影响病毒的包装和感染效率,因此本论文的改造目标主要是pⅨ。结构分析表明,腺病毒衣壳每个面上的pⅨ连接形成一个四个三聚物的网络结构。在这个模型中,四聚化结构域中的三个C端暴露在外,而第四个与之反平。针对于该结构模型的特点,而pⅨ的C末端可以插入外源片段,将非常有利于三聚体结构的外源蛋白的插入修饰。如果我们能找到一个可特异针对肿瘤细胞表面受体且生物活性结构为三聚体形式的治疗基因,用它来修饰腺病毒pⅨ的C末端,会使腺病毒载体获得很好的肿瘤靶向性,且能最大限度的保护治疗基因的生物活性结构。肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体（tumor necrosis factor related apoptosis-inducing ligand,TRAIL）,无论是在生物功能还是在空间结构上都非常符合我们的要求。TRAIL以活性三聚体形式与肿瘤细胞表面的死亡受体结合后,可以激活死亡受体途径及线粒体途径的凋亡信号诱导多种肿瘤细胞凋亡而对正常细胞无毒性。据文献报道,除重组TRAIL蛋白具有很强的抗肿瘤活性外,利用病毒类载体或非病毒类载体,将TRAIL基因转导入肿瘤细胞中进行基因治疗,同样可以有效地诱导肿瘤细胞凋亡。此外,重组TRAIL通过静脉或腹腔的给药形式也表明其具备一定的肿瘤靶向潜力。但是,一些临床数据表明,TRAIL的抗肿瘤功能依赖于其活性三聚体结构,而这个结构由于自身特点极不稳定,且蛋白的半衰期很短,这在很大程度上影响了它的治疗效果。因此本论文设计利用一种亮氨酸拉链异二聚体系统,将其中一个单链Zipper融合到pⅨ的C末端,而将与其配对的Zipper融合到溶瘤腺病毒表达TRAIL的N末端,这样载体表达的三聚体形式的TRAIL将通过Zipper配对修饰到完成装配出细胞的病毒的衣壳表面。该载体的特点是仅以短肽修饰pⅨ,因此不会影响病毒的包装,载体表达的TRAIL除直接诱导肿瘤细胞凋亡外,还将稳定连接到子代病毒的衣壳蛋白表面,在增强溶瘤病毒的肿瘤特异靶向性的同时增加自身稳定性从而获得更强的肿瘤抑制活性。论文在完成骨架质粒的基因修饰和穿梭载体的相关构建后,通过共转293细胞成功包装出了 pⅨ修饰的腺病毒载体。随后通过CsCl梯度密度离心和免疫电镜证实纯化后的腺病毒表面有TRAIL蛋白的存在。为进一步分析病毒表面TRAIL的生物学活性,我们在改造重组腺病毒载体感染肿瘤细胞的不同阶段,分别检测了重组腺病毒对肿瘤细胞的抑制活性。对比未修饰载体发现,pⅨ修饰的载体在病毒感染的早期（6小时内）即对肿瘤细胞产生了更好的凋亡活性,而在感染持续到72小时后,溶瘤腺病毒载体则表现出了更为显著的肿瘤杀伤活性,这表明连接到腺病毒表面的TRAIL蛋白不但保持了其生物活性,也显著增强了溶瘤腺病毒载体的抗肿瘤活性。腺病毒载体的传统给药途径是瘤内注射,虽然局部药物浓度很高,但扩散受限,对于较大肿瘤需要多部位注射,增加操作次数,且分布不均。而大多数恶性肿瘤手术或放疗后复发都是多中心的,所以瘤体内直接注射病毒并不适宜。腺病毒载体的全身给药目前还未被广泛接受,这主要是由于这种给药方式的病毒往往会出现肝富集,而极少能够到达原发部位及转移灶。本论文利用小动物活体成像系统检测腺病毒载体的报告基因红色荧光蛋白RFP的表达,结果显示,荷瘤小鼠在静脉注射pⅨ修饰的溶瘤腺病毒4天后,能在肿瘤组织处检测到RFP的表达,且随着时间的增加荧光信号越来越强。而其他正常组织的病毒分布很少,特别是在肝组织处的病毒量远远低于没有改造的重组溶瘤腺病毒组,这表明pⅨ修饰后表面携带TRAIL的溶瘤腺病毒获得了肿瘤靶向的性质,且在肿瘤组织处有很好的特异性复制。随后,我们对pⅨ修饰的溶瘤腺病毒载体的抗肿瘤活性进行了深入分析。在体外实验中,pⅨ修饰溶瘤腺病毒对于多种肿瘤细胞（ZR-75-30、MCF-7、Hela、MGC80-3、APNC-1、HepG-2等）都有良好的抗肿瘤效果,而对正常细胞（MCF-10A、CCD-11Lu、QSGC-7701等）没有毒副作用。体内实验首先建立了乳腺肿瘤细胞ZR-75-30的小鼠模型,然后对荷瘤小鼠以瘤内注射和静脉注射两种方式注射重组腺病毒,评价肿瘤治疗效果。相比于常规的溶瘤腺病毒,改造修饰的rAd5zp-zTRAIL-RFP-SA24Ela无论是瘤内给药还是静脉给药都显示出更显著的抗肿瘤效果,治疗2周后的小鼠肿瘤组织处能检测到明显的caspase-3活性。同时,HE染色实验表明无论何种给药方式pⅨ修饰的溶瘤腺病毒载体均不会对实验鼠的肝肾组织造成损伤或毒性,显示了良好的安全性。综上,本论文成功获得了一种新型的具有肿瘤靶向功能的溶瘤腺病毒基因治疗载体,该载体可通过静脉给药,在TRAIL的选择性引导下利用血液循环将溶瘤腺病毒运输到肿瘤组织,发挥基因治疗和病毒溶瘤的双重抗肿瘤活性。本论文的研究为溶瘤腺病毒基因治疗载体的进一步研究和应用提供了良好的基础。