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目的:本实验中利用ELISA、MTT和Western Blotting等实验检测的方法,探究乙醛刺激肝星状细胞活化过程中TGF-β信号通路相关的机制,并通过刺激肝星状细胞活化的方法来观察TGF-β信号通路的功能及效应。首先,乙醛刺激肝星状细胞株并设置不同的刺激时间,可通过MTT法来检测活化肝星状细胞的增殖水平;通过ELISA法测定肝星状细胞内纤维粘连素FN以及胶原蛋白I含量,证明乙醛能有效得刺激肝星状细胞株的活化,并比较不同刺激时间的差异。接着采用SB-431542特异性阻断TGF-β信号通路结合乙醛刺激HSC细胞,Western blotting检测HSC内ZEB1、α-SMA、Smad3和p-Smad3-S425的表达,以探究TGF-β信号通路相关机制。方法:①将细胞株分组为:(1)正常培养12小时,(2)正常培养24小时,(3)正常培养36小时,(4)TGF-β阻断正常培养24小时,(5)TGF-β阻断乙醛24小时刺激培养,(6)乙醛12小时刺激培养,(7)乙醛24小时刺激培养,(8)乙醛36小时刺激培养。培养相应组的细胞到细胞融合度为70%至80%时,用胎牛血清含量为0.4%的DMEM培养基培养12小时即是对各组细胞进行了同步化处理,之后再用胎牛血清含量为10%的DMEM完全培养基进行培养,其中24小时TGF-β阻断正常培养组细胞培养前先用抑制剂(SB-431542最终浓度是10μmol/L)进行处理,24小时乙醛刺激TGF-β阻断组给予乙醛刺激(最终浓度是200μmol/L)前先用对应的抑制剂(SB-431542最终浓度是10μmol/L)预处理1小时,刺激满12小时补加一次乙醛刺激,刺激时间一到就可收取细胞。然后对细胞总蛋白进行提取,用G250法测出细胞中总蛋白的含量,SDS-PAGE电泳对蛋白进行分离以及用Western Blotting实验方法检测出效应蛋白的含量,Western Blotting检测的目标有:ZEB1、α-SMA、Smad3和p-Smad3-S425的表达。然后将图谱经Quantity One软件进行处理和分析,根据Western膜上的蛋白条带相应灰度值进行比较分析。②HSC-T6细胞株分组仍然为:(1)正常培养12h,(2)正常培养24h,(3)正常培养36h,(4)TGF-β阻断正常培养24h,(5)TGF-β阻断乙醛24小时刺激培养,(6)乙醛12小时刺激培养,(7)乙醛24小时刺激培养,(8)乙醛36小时刺激培养。将HSC-T6细胞株接种到96孔培养板中,每组设有3复孔,培养各组细胞到细胞融合度为70%至80%时,用胎牛血清含量为0.4%的DMEM培养基培养12小时即是对各组细胞进行了同步化处理,之后再用胎牛血清含量为10%的DMEM完全培养基进行培养,其中24小时TGF-β阻断正常培养组细胞培养前先用相应抑制剂(SB-431542最终浓度是10μmol/L)进行处理,24小时乙醛刺激TGF-β阻断组给予乙醛刺激(最终浓度是200μmol/L)前先用相应的抑制剂(SB-431542最终浓度是10μmol/L)预处理1小时,然后每隔12小时补加一次乙醛刺激。各组细胞处理完毕后,细胞生长的情况即可通过光镜进行观察,并可通过ELLSA法检测胶原蛋白Ⅰ和纤维粘连素FN的含量变化,以及利用MTT法检测细胞活性有无变化。结果:①肝星状细胞经乙醛刺激后可被激活,激活表现为:胶原蛋白Ⅰ和纤维粘连素FN在ELLSA法检测中含量均有一定的增加,细胞增值活性用MTT法检测得出增强很多。说明酒精的代谢产物乙醛可刺激肝星状细胞的活化。加入阻断剂后,MTT测定结果显示细胞活性明显下调,Ⅰ型胶原蛋白(TIMPⅠ)和纤维粘连素(FN)含量也明显下调。②正常培养对照组HSC中α-SMA、ZEB1和p-Smad3-S425的表达均有上调,说明HSC具有基础活性;乙醛刺激组较对照组显著上调α-SMA、ZEB1和p-Smad3-S425的表达;TGF-β通路阻断对α-SMA、ZEB1和p-Smad3-S425的表达上调均有明显的抑制作用。③刺激时间比较得出:各项指标的改变随刺激时间延长逐渐增高,至24h达到最高峰,36h略有下降。结论:①乙醛对肝星状细胞的活化有明显的刺激作用,乙醛激活HSC细胞后,可以使HSC细胞大量增殖并转分化。②乙醛激活肝星状细胞的增殖及转分化效应在24小时左右达最高峰。③乙醛可通过刺激TGF-β信号通路导致肝星状细胞激活并转分化,SB-431542特异性阻断TGF-β信号通路后可有效抑制乙醛激活HSC细胞。④TGF-β信号通路的激活,以及效应蛋白α-SMA和转录因子ZEB1表达上调,提示TGF-β信号通路与EMT存在相关性。