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目的随着人们对疾病治疗认识的转变,应用免疫增强剂调节机体免疫功能的想法,引起了学者们广泛地关注。免疫增强剂(immuno stimulants),经常被用来作为肿瘤疾病的治疗药物,是一种单独或同时与抗原使用的时候能增强机体免疫应答的物质。顺铂、环磷酰胺、氮芥等细胞毒类抗肿瘤药物对肿瘤细胞缺乏足够的选择性,因此此类药物对肿瘤细胞、正常细胞均具有杀伤作用,进而对患者的生活质量造成严重影响。长期使用化疗药物可降低机体免疫调节功能,其不良表现主要包括骨髓抑制、白细胞减少、血小板减少等。研究者们通过体内、体外免疫功能调节实验力求研发安全可靠的具有增强机体免疫功能的植物性药物,此种类型的天然免疫增强剂有望改善化疗药物诱导的机体免疫调节能力抑制作用。本论文通过体外淋巴细胞增殖实验、NK细胞杀伤实验筛选复方红景天(Composite Rhooiolarosea)最优配方,与此同时,根据初步实验中筛选出的最优发酵条件,发酵人参和红景天。通过体内免疫功能调节实验,比较发酵复方红景天(Fermented Composite Rhodiola rosea,FCRr)和未发酵复方红景天(Non-fermented Composite Rhodiola rosea,NCRr)免疫功能增强作用及其作用机制。方法1.采用活性酵母分别提取红景天和人参。通过析因设计试验,根据各组复方红景天对体外小鼠免疫功能的测定值,选择复方红景天最优配方组合。2.采用血清药理学实验方法,取9只大鼠,按动物实验推荐剂量的5倍剂量给大鼠灌胃配伍组成的9组组方药物,连续灌胃5天,末次给药2小时,使用乙醚麻醉,无菌条件下摘取眼球取血,收集含药血清。采用体外MTT比色法,检测9组复方配伍组对Con A、LPS诱导的脾细胞增殖能力及NK细胞杀伤能力。3.体内免疫功能调节实验方法:按照随机分组原则,将60只雄性小鼠分为空白对照组,免疫抑制模型组,FCRr高、低剂量组,NCRr高、低剂量组,每组各10只。实验第一天至第三天腹腔注射环磷酰胺(100mg/kg),制作小鼠免疫功能低下模型,此后持续灌胃各组药物15天,测定各组小鼠脏器比值、外周血白细胞数、淋巴细胞增值能力、NK细胞杀伤活性。采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定白介素-2(IL-2),干扰素(IFN-,γ),肿瘤坏死因子(TNF-α)。结果1.人参和红景天最优组合比例筛选结果表明:红景天和人参复方组与各自的单味组相比,可以显著提高淋巴细胞增殖能力,其差异有统计学意义(P<0.01)。与空白对照组比较,在未进行发酵处理的各组药物中,未发酵红景天高剂量+未发酵人参高剂量配伍组(红景天0.6 g/kg,人参1 g/kg)可以显著增加ConA、LPS诱导的T、B淋巴细胞增殖能力及NK细胞杀伤活性(P<0.01);未发酵红景天低剂量+未发酵人参低剂量配伍组(红景天0.3 g/kg,人参0.5 g/kg)可以显著增加ConA、LPS诱导的T、B淋巴细胞增殖能力及NK细胞杀伤活性(P<0.01)。与空白对照组相比,经过发酵处理的各组药物中,发酵红景天高剂量+发酵人参高剂量配伍组可以显著增加ConA、LPS诱导的T、B淋巴细胞增殖能力及NK细胞杀伤活性(P<0.01);发酵红景天低剂量+发酵人参低剂量配伍组比空白对照组显著增加ConA、LPS诱导的T、B淋巴细胞增殖能力及NK细胞杀伤活性(P<0.01)。2.体内实验结果表明:环磷酰胺对小鼠外周血中的白细胞数具有显著的抑制作用,FCRr高、低剂量组及NCRr高、低剂量组均可以显著提高由环磷酰胺抑制的,小鼠外周血白细胞数量,其差异具有统计学意义(P<0.01)。FCRr高、低剂量组小鼠外周血白细胞数均高于NCRr高、低剂量组,与NCRr低剂量组相比,FCRr低剂量组可以显著提高白细胞数量,其差异具有统计学意义(P<0.01)。3.淋巴细胞转化能力检测结果表明:与空白对照组相比,环磷酰胺可以显著抑制由Con A,LPS诱导的小鼠T淋巴细胞、B淋巴细胞增殖能力,其差异具有统计学意义(P<0.01)。与环磷酰胺组比较,FCRr高、低剂量组及NCRr高、低剂量组均可以显著提高免疫抑制模型小鼠T淋巴细胞、B淋巴细胞增殖能力,其差异具有统计学意义(p<0.01)。FCRr高、低剂量组对小鼠T淋巴细胞、B淋巴细胞的增殖能力均高于NCRr高、低剂量组对小鼠T淋巴细胞、B淋巴细胞增殖能力,其差异具有统计学意义(P<0.01)。4.NK细胞杀伤活性检测结果表明:与空白对照组相比,环磷酰胺可以显著抑制小鼠NK细胞杀伤活性,其差异具有统计学意义(P<0.01)。与环磷酰胺组相比FCRr高、低剂量组及NCRr高、低剂量组均可以显著提高免疫抑制模型小鼠的NK细胞杀伤活性,其差异具有统计学意义(P<0.01)。FCRr高、低剂量组提高小鼠NK细胞杀伤活性能力均高于NCRr高、低剂量组,其差异具有统计学意义(P<0.01)。5.白细胞介素-2(IL-2)含量的测定结果表示:与空白对照组相比,环磷酰胺可以显著抑制小鼠血清IL-2的含量,其差异具有统计学意义(P<0.01)。与环磷酰胺组相比FCRr高、低剂量组及NCRr高、低剂量组均可以显著提高免疫抑制模型小鼠,血清IL-2的含量,其差异具有统计学意义(P<0.01)。FCRr高、低剂量组小鼠血清IL-2的含量均高于NCRr高、低剂量组小鼠血清IL-2的含量,其差异具有统计学意义(P<0.01)。6.干扰素(IFN-γ)含量的测定结果表示:与空白对照组相比,环磷酰胺可以显著抑制小鼠血清IFN-y的含量,其差异具有统计学意义(P<0.01)。与环磷酰胺组相比,FCRr高、低剂量组可以显著提高免疫抑制模型小鼠,血清IFN-γ的含量,其差异具有统计学意义(P<0.01)。与环磷酰胺组相比,NCRr高剂量组可以显著提高免疫抑制模型小鼠血清IFN-γ的含量,其差异具有统计学意义(P<0.01)。FCRr高、低剂量组小鼠血清IFN-y的含量均高于NCRr高、低剂量组小鼠血清IFN-γ的含量,其差异具有统计学意义(P<0.01)。7.肿瘤坏死因子(TNF-α)含量的测定结果表示:与空白对照组相比,环磷酰胺可以显著抑制小鼠血清TNF-α的含量,其差异具有统计学意义(P<0.01)。与环磷酰胺组相比FCRr高、低剂量组及NCRr高、低剂量组均可以显著提高免疫抑制模型小鼠,血清TNF-α的含量,其差异具有统计学意义(P<0.01)。FCRr高、低剂量组小鼠血清TNF-α的含量均高于NCRr高、低剂量组小鼠血清TNF-α的含量,其差异具有统计学意义(P<0.01)。结论1复方红景天、人参提取物体外免疫调节最佳配伍剂量为:高剂量为0.6 g/kg红景天和1 g/kg人参;低剂量为0.3 g/kg红景天及0.5 g/kg人参。2.红景天和人参复方体内免疫调节作用最佳剂量为FCRr高、低剂量组(800mg/kg,400mg/kg)及 NCRr 高、低剂量组(800mg/kg,400mg/kg)。3.利用活性酵母发酵红景天和人参,将显著提高其增强免疫功能的活性,此方法简便易行。