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鸭疫里默氏杆菌（Riemerella anatipestifer,RA）是感染鸭的重要病原性细菌之一,易产生耐药性,血清型复杂且各血清型之间缺乏交叉保护性。灭活疫苗和弱毒活疫苗可用于免疫预防该细菌的感染,但由于各养鸭地区或养殖场在不同时期流行菌株的血清型不一致,未能广泛应用于养鸭业。亚单位疫苗主要是采用提取或其他生物工程方法将病原体中引发机体免疫应答的主要成分制备而成的疫苗。此类疫苗一方面减轻了常规全菌体疫苗存在的免疫副反应问题,另一方面为进行精确免疫及多种病原体的联合免疫提供了新的发展思路,同时还为解决RA各血清型间的交叉保护性问题提供了一种新的方式。在RA亚单位疫苗方面主要开展了以荚膜或外膜蛋白为亚单位成分的免疫研究,但大多还处在试验阶段。本研究根据相关文献选择了多种RA蛋白,在生物信息学分析及原核表达的基础上,通过体外及体内试验评价其免疫保护性,为进一步研发亚单位疫苗奠定基础。1.生物信息学分析根据文献,选取了鸭疫里默氏杆菌PTI、DUF等10种蛋白进行分析。使用DNAstar软件中的Meg Align（By W Method）对不同RA菌株中蛋白编码基因的核苷酸序列进行相似性比对分析。PTI、ETP、Omp62、CZS、ECE和Tuf等在各菌株中分别为1272bp、1437bp、648bp、501bp、2070bp和1188bp,相似性均在90%以上;DUF、β-OMP、Omp60和Omp10在部分参考菌株中存在,核苷酸序列的长度存在差异,相似性在75%-100%。利用PSORT网站对蛋白进行亚细胞定位,结果显示,除Tuf外均为外膜蛋白。利用Vaxign2.0网站对蛋白抗原性进行预测,结果显示,各蛋白抗原性均大于阈值0.4,能引起机体免疫反应。利用Ex PASy网站对蛋白理化性质进行分析,结果显示,各蛋白均为疏水性蛋白、无跨膜区,不稳定指数均小于阈值40。利用Signal P网站分析信号肽,结果显示,PTI、Omp10含信号肽,其余蛋白不含信号肽。2.候选蛋白基因的原核表达及多克隆抗体制备根据蛋白编码基因设计特异性引物,以RA AF株细菌基因组DNA为模板进行PCR扩增及T-A克隆、测序,除Omp10外的序列与设计引物的模板序列相似性均在95%以上。克隆及测序的DNA片段以原核表达质粒p ET32a（+）（或p Cold-TF）构建原核重组表达载体,以E.coli BL21（ED3）为表达宿主菌进行原核表达。经IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测获得与预期大小一致的蛋白条带。将诱导表达产物SDS-PAGE,切取含目的蛋白的凝胶条带,匀浆处理后作为免疫抗原,免疫动物制备多克隆抗体。经Western-blot检测,抗重组蛋白血清能与重组蛋白发生特异性反应。以RA AF株细菌菌体超声波裂解产物为包被抗原进行间接ELISA检测抗体效价,抗重组蛋白Omp60、ECE血清效价为1:400,抗重组蛋白β-OMP、PTI血清效价为1:800,抗重组蛋白ETP、Tuf血清效价为1:1600,抗重组蛋白DUF、Omp62、Omp10、CZS血清效价为1:3200。抗重组蛋白Omp60卵黄抗体效价为1:800,抗重组蛋白Omp10卵黄抗体效价为1:1600,抗重组蛋白Omp62、ECE卵黄抗体效价为1:3200。3.重组蛋白与RA感染鸭恢复期血清的反应性将重组蛋白进行SDS-PAGE后转印至PVDF膜,以鸭感染RA后的恢复期血清为一抗,HRP标记的兔抗鸭Ig G为酶标二抗进行免疫印迹试验。结果显示,重组蛋白ECE与RA AF株（血清2型）感染鸭恢复期血清反应为阳性,重组蛋白ECE、Omp60、Omp10与RA 47株（血清1型）感染鸭恢复期血清反应为阳性,其余均为阴性。4.抗重组蛋白血清与RA全菌蛋白的反应性鸭疫里默氏杆菌菌体超声波裂解,经变性SDS-PAGE后进行免疫印迹试验。结果显示,除ETP、CZS重组蛋白抗血清与AF株细菌菌体蛋白没有印迹带外,其余8种抗血清均在预期的位置出现印迹条带;而与47株的菌体蛋白反应,抗重组蛋白PTI、β-OMP、ETP和Tuf等4种抗血清无印迹条带。5.血清杀菌试验以鸭疫里默氏杆菌AF株细菌作为指示菌进行血清杀菌活性的测定,结果显示抗重组蛋白Omp62、Omp60、Omp10和ECE抗体可以增强血清的杀菌活性（P＜0.05）,细菌相对存活率分别为6%、18%、11.3%和17.7%,且存在剂量应答关系。以鸭疫里默氏杆菌47株细菌作为指示菌进行血清杀菌活性的测定,结果显示抗重组蛋Omp62、Omp60、Omp10和ECE抗体同样可以增强血清的杀菌活性（P＜0.05）,细菌相对存活率分别为26.3%、21.4%、18.3%和15.3%。以上结果表明,抗重组蛋白Omp62、Omp60、Omp10和ECE抗体均可增强血清对鸭疫里默氏杆菌的杀菌活性。6.全血杀菌试验以鸭疫里默氏杆菌AF株细菌作为指示菌进行全血杀菌试验,结果显示,抗重组蛋白Omp62、Omp60、Omp10和ECE抗体可以增强全血杀菌活性（P＜0.05）,其相对杀菌率分别为69.3%、70%、78%和58.3%,且存在剂量应答关系。以鸭疫里默氏杆菌47株细菌作为指示菌进行全血杀菌试验,结果显示抗重组蛋Omp62、Omp60、Omp10和ECE抗体同样可以增强全血杀菌活性（P＜0.05）,其相对杀菌率分别为68%、72%、73.6%和52.6%。以上结果表明,抗重组蛋白Omp62、Omp60、Omp10和ECE抗体可以增强鸭全血对鸭疫里默氏杆菌的杀菌作用。7.被动免疫保护试验在实验室条件下饲喂8日龄雏鸭,用RA AF株细菌超声波裂解产物为抗原进行ELISA检测血清抗体效价,血清1:800稀释,测得OD450值小于0.2的动物饲喂至10日龄用于被动免疫保护试验。试验鸭注射抗重组蛋白卵黄抗体后24h用RA AF株强毒进行人工感染,试验中设阴性卵黄抗体对照和阳性抗体对照组。阴性卵黄抗体对照组于攻毒后36h开始发病,60h开始死亡,在观察期内发病率为75%、死亡率37.5%;抗重组蛋白Omp60卵黄抗体组于攻毒后60h发病,84h死亡,发病率为25%、死亡率为12.5%;抗重组蛋白Omp62、Omp10、ECE卵黄抗体组均于攻毒后60h发病,发病率均为12.5%、无死亡;组合卵黄抗体组、阳性抗体对照组在观察期内均无动物发病及死亡。抗重组蛋白Omp62、Omp10、ECE和组合卵黄抗体组免疫保护率均为100%,抗重组蛋白Omp60卵黄抗体组免疫保护率为66.7%。以上结果表明,抗重组蛋白Omp62、Omp10、ECE、Omp60卵黄抗体能延迟发病及死亡时间,降低发病率及死亡率。8.主动免疫保护试验在实验室条件下饲喂雏鸭,于5日龄及16日龄用重组蛋白抗原进行二次免疫及第二次免疫后第14d人工感染毒。第二次免疫后第9d和第14d外周全血对RA AF株细菌的相对杀菌率均达80%以上（P＜0.001）。第二次免疫后第14d血清抗体用间接ELISA检测,当待检血清稀释倍数为1:200时,重组蛋白Omp62、Omp60、Omp10、ECE和组合免疫组的P/N值分别为2.97、1.80、1.89、1.94和2.30。攻毒后12h,各重组蛋白免疫组外周血细菌数均低于对照组,其中重组蛋白Omp60、组合免疫组与对照组相比差异显著（P＜0.05）。攻毒后36h,各重组蛋白免疫组外周血细菌数均低于对照组,其中重组蛋白Omp60免疫组与对照组相比差异显著（P＜0.05）。对照组于攻毒后12h开始发病,36h发病率达100%;24h开始死亡,96h死亡率达100%。重组蛋白Omp62、Omp60、Omp10、ECE和组合免疫组的发病时间集中于攻毒后24-48h,发病率分别为57.1%、40%、66.6%和71.4%;死亡时间集中于攻毒后48-72h。重组蛋白Omp62、Omp60、Omp10、ECE和组合免疫组免疫保护率分别为33.3%、57.2%、80%、33.3%和42.9%。以上结果表明,重组蛋白免疫能降低外周血的细菌数量,延迟发病及死亡时间,降低发病率及死亡率。综上所述,经血清及全血杀菌试验、被动和主动免疫保护试验初步测定,鸭疫里默氏杆菌Omp62、Omp60、Omp10和ECE等4种蛋白是免疫保护性抗原。