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三棱莪术方(Sanlenge’zhu Decoction,SLEZD)是治疗消化道肿瘤(Gastrointestinal Tumor,GT)的有效组方,也是江苏省中医院刘沈林教授治疗肿瘤的经验方中的君药,但其药效学机制尚不明确,本课题针对三棱莪术方的药效学机制进行研究。本课题的研究内容包括:体外实验,培养人胃癌SGC-7901细胞,采用MTT法检测三棱莪术方对人胃癌SGC-7901细胞增殖的影响,通过流式细胞仪检测三棱莪术方对人胃癌SGC-7901细胞凋亡和周期的影响,探讨三棱莪术方抑制胃癌细胞生长的机制;体内实验,建立人胃癌细胞SGC-7901裸小鼠移植瘤模型,研究三棱莪术方对胃癌的药效学机制;建立结肠癌细胞HCT-116裸小鼠移植瘤模型,研究三棱莪术方对结肠癌的药效学机制;建立肝癌H22细胞小鼠移植瘤模型,研究三棱莪术方对肝癌的药效学和免疫学机制;采用大黄水煎液建立脾虚动物模型,研究三棱莪术方对脾虚动物的胃肠功能及血清消化酶和胃肠激素的影响。第一部分,体外实验,采用MTT法和流式细胞仪分别检测三棱莪术方对人胃癌SGC-7901细胞的增殖、凋亡及周期的影响。结果:人胃癌SGC-7901细胞与药物共同培养48h后,MTT法检测三棱莪术方(8,16,32mg/ml)对人胃癌SGC-7901细胞有明显的抑制作用(p<0.05),抑制率分别为7.58%、8.16%、32.53%,呈剂量依赖性,IC 50值为43.30mg/ml;经流式细胞仪检测,三棱莪术方可增加人胃癌SGC-7901细胞早期凋亡和晚期凋亡的数量(p<0.01),并成浓度依赖性,表现出明显的量效关系;三棱莪术方(20,40,80mg/ml)对人胃癌SGC-7901细胞干预24h,在S期的细胞比例明显增加,G0/G1、G2/M的比例有所减少(p<0.01)。提示:三棱莪术方对人胃癌SGC-7901细胞的增殖有一定的抑制作用;可使人胃癌SGC-7901细胞的早期凋亡、晚期凋亡及坏死细胞的比例明显增加,并呈时间和剂量依赖性,将细胞周期阻滞于S期,阻止肿瘤细胞由S期进入G2/M期,三棱莪术方可能通过阻滞细胞周期来发挥抑制人胃癌SGC-7901细胞增殖的作用。第二部分,培养人胃癌SGC-7901细胞,接种于BALB/C-裸鼠右前肢腋窝皮下制成裸小鼠移植瘤模型,观察三棱莪术方对裸小鼠移植瘤模型的体重、瘤重、瘤体积、抑瘤率、瘤组织病理检查和血清蛋白 COX-2、VEGF、bFGF表达的影响。结果:与模型组比较,三棱莪术方对人胃癌细胞SGC-7901裸小鼠移植瘤模型的体重无显著性影响(p>0.05);三棱莪术方高、中、低剂量组裸小鼠移植瘤模型的肿瘤重量明显减轻(p<0.01),抑瘤率分别为63.60%、61.52%、42.51%;病理组织学检查显示,三棱莪术方高、中剂量组裸小鼠移植瘤模型的肿瘤组织坏死面积比模型组明显增加(p<0.05);ELISA法检测三棱莪术方高、中、低剂量组裸小鼠移植瘤模型的血清COX-2值给药8周后比模型组明显降低(p<0.05,p<0.01);三棱莪术方高、中剂量组裸小鼠移植瘤模型的血清VEGF、bFGF值给药8周后比模型组明显降低(p<0.05,p<0.01)。提示:三棱莪术方具有抑制人胃癌细胞SGC-7901移植瘤生长和促进肿瘤组织坏死的作用,抑瘤率与药物的浓度呈正相关,其机制可能是通过下调人胃癌细胞SGC-7901裸小鼠移植瘤模型血清中COX-2、VEGF和bFGF蛋白表达实现的。第三部分,培养人结肠癌细胞HCT-116,接种于BALB/C-裸鼠右前肢腋窝皮下制成裸小鼠移植瘤模型,观察三棱莪术方对裸小鼠移植瘤模型的体重、瘤体积、抑瘤率、肺指数、瘤组织病理检查结果及瘤组织免疫组织化学指标PTEN、MMP-2、和VE-Cad的影响。结果:与模型组比较,三棱莪术方各剂量组裸鼠在给药后体重增长无显著性差异(p>0.05);三棱莪术方各剂量组裸鼠给药后肿瘤的体积明显增长缓慢,三棱莪术方高剂量组裸鼠给药后15天至实验末的肿瘤体积显著减小(p<0.05,p<0.01);三棱莪术方高剂量组裸小鼠移植瘤模型肺指数显著增高(p<0.01);三棱莪术方中、低剂量组裸鼠肺指数与模型组比较无显著性差异(p>0.05);三棱莪术方高剂量组裸鼠的肿瘤重量明显减轻(p<0.05),三棱莪术方高、中、低剂量组的抑瘤率分别为66.50%,58.60%,41.98%;三棱莪术方各剂量组裸鼠的肿瘤组织坏死面积明显增加(p<0.01);三棱莪术方高、中剂量组肿瘤组织的PTEN评分显著增高(p<0.05,p<0.01);三棱莪术方高、中剂量组肿瘤组织的MMP-2和VE-Cad评分显著降低(p<0.05,p<0.01)。提示:三棱莪术方可抑制人结肠癌细胞HCT-116移植瘤裸小鼠实体瘤的生长,并促进实体瘤的坏死,其可能机制是通过上调PTEN蛋白的表达并下调MMP-2和VE-Cad蛋白的表达实现的。第四部分,培养腹水瘤小鼠肝癌H22细胞,接种于ICR小鼠右前肢腋窝皮下制成小鼠移植瘤模型,观察三棱莪术方对肝癌H22细胞小鼠移植瘤模型胸腺指数、脾脏指数、T淋巴细胞计数、T淋巴细胞酯酶染色率、抑瘤率、迟发性超敏反应(DTH)、溶血素抗体生成和RES血液中碳粒吞噬廓清能力的影响。结果:与模型组比较,三棱莪术方高、低剂量组小鼠移植瘤模型的实体瘤重明显减小(p<0.05);三棱莪术方低剂量组T淋巴细胞数量显著增高(p<0.05);三棱莪术方高剂量组小鼠耳迟发型超敏反应的强度明显增强(P<0.01),肿胀抑制百分率为35.77%;三棱莪术方高、低剂量组均能明显促进小鼠溶血素抗体生成(p<0.01);三棱莪术方高、低剂量组对小鼠移植瘤模型RES血液中碳粒吞噬廓清能力促进作用不明显。提示:三棱莪术方对肝癌H22实体瘤的生长具有明显的抑制作用,具有增强T淋巴细胞酯酶染色率、抑制DNCB诱导的迟发型超敏反应的作用,促进小鼠移植瘤模型的细胞免疫和体液免疫。第五部分,由于消化道肿瘤患者多处于脾阳虚状态,本实验通过大黄水煎液(1g/ml)建立脾阳虚小鼠模型和脾阳虚大鼠模型,观察三棱莪术方对脾阳虚小鼠肠蠕动和胃动力的影响以及对脾阳虚大鼠血清中淀粉酶、乳酸脱氢酶、琥珀酸脱氢酶和胃肠激素MTL、SS、GAS的影响。结果:与模型组比较,三棱莪术方高、低剂量组对新斯的明致脾虚小鼠的胃残留率明显增加(P<0.01);三棱莪术方高剂量组对多巴胺致脾虚小鼠的炭末推进率明显降低(P<0.05);三棱莪术方高剂量组对多巴胺致脾虚小鼠的胃残留率明显增加(P<0.01);三棱莪术方高、低剂量组脾阳虚大鼠在给药二周和给药一周后体重明显增加(P<0.01,P<0.05);三棱莪术方高、低剂量组大鼠的AMS活力明显升高(P<0.01);三棱莪术方高、低剂量组大鼠的SDH的比活性比明显降低(P<0.01);三棱莪术方低剂量组大鼠的LDH活性明显降低(P<0.01);三棱莪术方高、低剂量组大鼠的血清MTL和GAS含量显著升高(P<0.01)。提示:三棱莪术方可改善脾虚小鼠的胃肠运动功能障碍;对脾虚大鼠的体重减轻具有改善作用,对脾虚大鼠紊乱的消化酶和胃肠激素具有调节作用。