手性文斯内酯（2-氮杂二环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮）是一种非常重要的医药中间体,（–）-文斯内酯可用于合成抗病毒药物阿巴卡韦和帕拉米韦等,而（+）-文斯内酯可用于合成美格列汀、MK-0812等药物靶标。不对称拆分外消旋文斯内酯法是获得光学纯文斯内酯的重要方法。相较于化学拆分法和物理重结晶法,利用立体选择性γ-内酰胺酶不对称水解外消旋文斯内酯合成手性文斯内酯的反应具有条件温和、光学纯度高、环境友好等优点,展现了巨大的工业应用价值。然而,目前的γ-内酰胺酶存在热稳定性不足、效率低等问题,因此开发高效和热稳定性γ-内酰胺酶具有重要的研究意义。本研究以DeLM为探针,采用基因挖掘的方法,基于活力和立体选择性的筛选获得了两个候选（+）-γ-内酰胺酶,为来源于Fusarium oxysporum的FoLM和来源于Thermaerobacter marianensis的TmLM。基于序列比对和系统进化树分析的结果,FoLM和TmLM为Ⅱ型（+）-γ-内酰胺酶,属于甲酰胺/乙酰胺酶家族。FoLM和TmLM的酶学性质表征。发现FoLM和TmLM的最适反应p H为7.0,最适反应温度为60°C,最优条件下的比活力分别为2.7 U·mg–1和13.7 U·mg–1。FoLM对文斯内酯的Km和Vmax分别为37.6 mmol·L-1和4.4μmol·min-1·mg-1,TmLM对文斯内酯的Km和Vmax分别为32.2 mmol·L-1和16.2μmol·min-1·mg-1。FoLM和TmLM均具有良好的热稳定性,在50°C的半衰期分别为32 h和33 h;在70°C的半衰期分别为17 h和20 h;甚至在90°C保温4 h后还保留一半的残余酶活。底物谱分析显示FoLM和TmLM均可催化ω-辛内酰胺水解,却难以催化ω-庚内酰胺、ω-月桂精内酰胺和己内酰胺等单环酰胺化合物,具有较高的底物专一性。考察重组FoLM和TmLM全细胞不对称拆分文斯内酯的反应效果。在60°C和p H 7.0最适条件下,发现E.coli p ET28a-TmLM相比E.coli p ET28a-FoLM具有更好的底物耐受性。当底物浓度为1.0 M时,可以在10 h内完成不对称拆分反应,转化率为51.1%,对映体过量值（ee）为99.9%。当底物浓度提高到1.5 M时,最终转化率仅为38.4%,继续延长反应时间转化率并未进一步提高。推断在反应过程中出现底物抑制现象,因此采用分批补加底物方式减弱抑制作用。最终在250 m L反应体系中,采用10 g·L–1冻干细胞可完成2.0 M(218 g·L–1)文斯内酯的不对称拆分,反应24 h后,转化率为50.2%和ee为99.6%,催化剂与底物产出比（substrate/catalyst,S/C）为21.8 g·g-1。经萃取和旋转蒸发后得到16.5 g产物,分离得率为60.5%,经核磁验证为（–）-文斯内酯。本文获得了两个热稳定的Ⅱ型（+）-γ-内酰胺酶FoLM和TmLM,可以专一性水解文斯内酯,建立了TmLM全细胞催化文斯内酯的不对称拆分反应,可实现2.0 M文斯内酯的不对称拆分反应。本文为手性γ-内酰胺化合物的高效合成提供了一种高效生物催化剂。