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盐碱地在我国分布广泛,随着人们生产活动的加剧,盐渍化还在进一步恶化。培育耐盐品种是解决盐碱地粮食生产的关键技术,然而大多数农作物对盐碱的耐受性较差,传统育种方法很难选育出真正的耐盐品种。植物抗逆机理研究的进展和相关基因的克隆为我们利用基因工程技术培育高产、抗逆、优质新品种提供了一条有效的途径。 盐碱对植物造成的主要伤害之一是渗透胁迫。高等植物尤其是抗性较强的植物,通过积累一些小分子渗调物质来抵御渗透胁迫造成的危害,其中甜菜碱(betaine)是最重要的一种。甜菜碱在多种生物体内积累,但在一些重要的农作物中并不积累,如水稻、马铃薯、番茄和烟草等。通过基因工程技术将甜菜碱合成的全套机制转移到这些重要的农作物中,使其具有合成甜菜碱的能力而提高其耐盐性。本研究利用来源于藜科盐生植物山菠菜的甜菜碱合成的两个相关基因CMO(胆碱单氧化酶)基因和BADH(甜菜碱醛脱氢酶)基因为供体,以粳稻和杂交籼稻恢复系、保持系为受体,通过基因枪或农杆菌转化法进行遗传转化,获得了转化植株,并经分子验证,目的基因已整合到水稻基因组中,表现出较好的耐盐能力。取得的主要研究结果如下: 1.分别以不同水稻品种的幼穗、幼胚和成熟胚作为外植体,建立了高效的转基因受体系统,并对其进行了优化。采取幼胚低温预处理、愈伤组织的干燥培养和抗性愈伤组织的预分化处理等措施,分别提高了愈伤组织诱导率、抗性愈伤获得率和出苗率。 2.获得了一批转CMO基因和BADH基因的潮霉素和G418抗性植株,PCR检测结果表明大多数抗性植株其选择标记基因与外源目的基因共整合,个别植株只整合了选择标记基因而丢失了目的基因。对随机抽取的PCR检测双阳性植株进行Southern blotting杂交检测分析,表明CMO和BADH基因均已整合到转基因水稻的基因组中。 3.潮霉素和G418抗性植株经室内初步盐胁迫诱导筛选后,在温室盐池中再次进行耐盐性鉴定,得到耐盐植株。发现有少数PCR阳性反应植株在盐胁迫过程中没有耐盐表现而死亡,少数阴性植株则有耐盐表现而存活的现象。 4.对转基因植株进行的室内和田间耐盐性鉴定中,转基因植株的耐盐性均比对照好,但个体间耐盐表现有差异。 5.对转基因水稻植株后代进行的遗传分析表明,大多数符合孟德尔单基因遗传规律,目的基因能稳定地遗传和表达。