论文部分内容阅读
研究背景从最新的流行病学调查来看,乳腺癌的发病率依旧呈逐年上升趋势。随着我国经济的不断发展,饮食结构也开始偏向西方发达国家,我国女性雌激素水平的上升,经期提前和延长都使得我国女性乳腺癌及妇科肿瘤发病率年年攀升。越来越多的年轻女性被诊断出乳腺癌。有国外资料显示,近三年我国女性的乳腺癌发病率的中位数比欧美发达国家早了十年。我国女性乳腺癌的发病率已经跃居恶性肿瘤第一位。随着现代诊疗技术的不断提高,乳腺癌的早期诊断越为精确,运用不同的治疗手法如:放疗、化疗、手术、内分泌及分子靶向治疗使得乳腺癌的总生存率有了显著的改善。虽然总的生存率得到了改善,但是会有30%—40%的患者出现复发和转移。目前乳腺癌的治疗手段仍是以手术为主的综合治疗,但是仅凭手术无法改善远期生存率。放化疗是治疗乳腺癌重要的辅助手段,患者通过放化疗可以取得一个较为理想的远期生存率,但是放化疗之后的副作用往往是患者所不能接受的,许多患者因放化疗的毒副反应而被迫停止治疗而造成乳腺癌的二次复发,长期的放化疗也会增加乳腺癌细胞的抵抗作用。因此我们便希望寻找更有效的辅助治疗方法来改善乳腺癌的远期生存率,同时该辅助疗法降低化疗对乳腺癌患者产生的毒副作用。维生素C（VitC）是临床上常用的一种辅助药物,但是在化疗时使用的剂量一般都比较小,根据国外一些文献报道大剂量的静脉注射（10g/日）对于肿瘤治疗是有效的。紫杉醇（PTX）是临床上乳腺癌的常用化疗药之一,是从红豆杉的树皮中提取的抗癌有效成分。使用PTX化疗会产生常见的化疗毒副反应,如:恶心,呕吐,脱发,头晕,头痛等。这也是化疗患者难以坚持的主要原因。寻找一种既可以提高化疗疗效又可以降低化疗毒副反应的方法就显得迫在眉睫。研究目的本研究以乳腺癌细胞MCF-7为研究对象,探讨VitC联合PTX在体外对乳腺癌细胞凋亡相关因子的影响,为以后乳腺癌的临床治疗提供新的方法和思路。材料与方法1.研究材料乳腺癌MCF-7细胞,VitC注射液,PTX2.研究方法第一部分:体外培养乳腺癌MCF-7细胞,使用MTS法分别检测VitC、PTX、VitC联合PTX对MCF-7的增殖抑制率,并计算出IC50值（抑制一半细胞增殖的药物浓度）。计算肿瘤细胞的增殖抑制率,使用金氏修正公式来计算两种药物之间是否为协同关系。第二部分:取对数生长期的MCF-7细胞,细胞计数后,铺板,每孔约1×105cells。静置于37℃,5%CO2培养箱中24小时待同步细胞周期。根据Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit产品试剂盒使用说明书依次加入试剂,最后使用流式细胞仪检测,实验重复3次。第三部:Western Blotting（免疫印迹法）检测增殖和凋亡相关蛋白,培养MCF-7细胞系待同步细胞周期后,根据实验设计加入不同药物,分别是VitC单药、PTX单药、PTX0.625mmol/L分别加VitC高中低三组,每组设3个复孔。按试剂盒说明提取总蛋白,检测Caspase-3和Bcl-2的表达,以β-actin为内参。使用Image J软件分析蛋白条带灰度值,实验重复3次。结果第一部分:VitC、PTX、VitC联合PTX对体外培养的乳腺癌MCF-7细胞具有不同程度的抑制作用,从实验结果来看,呈浓度相关性。低剂量的VitC单药（<1.25mmol/L）对乳腺癌MCF-7细胞几乎没有影响。大剂量的VitC单药（>1.25mmol/L）对MCF-7细胞的增值抑制率呈浓度相关。PTX单药对MCF-7的增殖呈药物浓度依赖性。1mmol/LVitC分别于0.00475μmol/L、0.00237μmol/L、0.00118μmol/L的PTX联合用药增殖抑制率分别为82%、67%、50%。第二部分:正常对数期的乳腺癌MCF-7细胞与上皮细胞一样,显微镜下呈上皮样生长,细胞多形性,轮廓清晰,死亡和凋亡细胞数量都较少。经VitC单药不同浓度、PTX单药、VitC不同浓度联合PTX固定浓度作用后,使用流式细胞仪检测每组凋亡率,多组间使用单因素方差分析（one-way ANOVA）,组间两两比较使用SNK-q检验,VitC 0.5mmol/L组与对照组相比较,凋亡率无明显差别,差异无统计学意义（P>0.05）。PTX组和VitC联合PTX组与对照组相比较,凋亡率有明显差别,差异有统计学意义（P<0.05）。VitC联合PTX组与PTX组相比较,凋亡率有明显差别,差异有统计学意义（P<0.05）。第三部分:检测Caspase-3和Bcl-2的表达。乳腺癌MCF-7细胞经PTX单药及与不同浓度的VitC联合作用,随着VitC浓度的增加凋亡抑制蛋白Bcl—2的表达逐渐降低,凋亡促进蛋白Caspase-3的表达逐渐升高。PTX单药、PTX组+VitC 0.5mmol/L组、PTX组+VitC 1mmol/L组、PTX组+VitC 2mmol/L组与空白对照组比较蛋白相对表达量差异有统计学意义（P<0.05）。结论1.VitC单药、PTX单药和VitC联合PTX均可以对MCF-7增殖产生浓度抑制作用,而VitC单药在大于1.25mmol/L之后才呈浓度相关性。2.VitC单药、PTX单药和VitC联合PTX均可以对MCF-7凋亡产生浓度促进作用。3.VitC可以增敏PTX,使得凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达逐渐降低,凋亡促进蛋白Caspase-3的表达逐渐升高。