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目的:该试验以本地犬为试验动物构建了角膜高危病理模型,并行穿透性角膜移植手术,探讨高危病例的手术操作以及比较不同药物控制术后免疫排斥反应的疗效。
方法:(1)选择健康本地犬45只作为试验犬,使用1mol/L的NaoH溶液对所有试验犬左眼进行碱烧伤建立角膜高危病例模型,术后每天使用裂隙灯对术眼进行观察并测量新生血管长度。(2)将45只碱烧伤模型犬作为受体,选择23只健康本地犬作为供体犬,进行穿透性角膜移植手术,并对术中和术后的并发症进行监控,术后每天裂隙灯检查术眼情况。分别测定术眼术前、烧伤后和术后第5d的眼压。(3)选择3只健康本地犬,取左眼为试验眼进行药物刺激试验。使用1％RAPA滴眼液进行滴眼一周,每日进行裂隙灯检查,观察期满取试验眼进行组织学检查。将45只术犬随机分为三组,生理盐水组,CSA组和RAPA组,每组各15只术犬,每天行裂隙灯检查,连续观察角膜排斥情况60d。并于术后第10d、30d、60d各组随机抽取3只试验犬取术眼角膜进行组织病理学检查,观察各组角膜组织结构情况。(4)选择3只健康未手术犬为对照,构建含有犬VEGF基因的重组质粒VEGF-pMD19-T和含有犬β-A ctin基因的重组质粒β-A ctin-pMD19-T,将其质粒标准品进行荧光定量PCR,获得符合荧光定量PCR条件的标准曲线、融解曲线和扩增曲线,用于犬VEGF和β-Actin基因的组织表达研究。选择45只术犬为研究对象,分别于术后第10d、30d、60d各组随机抽取3只试验犬取术眼角膜进行荧光定量PCR检测,最后使用△△Ct法分析角膜组织VEGF基因的相对表达量。
试验结果:(1)烧伤后整个角膜出现高度水肿现象。角膜缘毛细血管扩张,从第3d开始新生血管开始从角巩膜缘向角膜内浸润。随烧伤时间的推移,新生血管不断长入角膜内,并呈明显上升趋势,烧伤后第9d,较多粗大的新生血管长入角膜中央,病理模型建立成功。(2)所有45只术犬在手术过程中和术后并发症情况为:角膜植片内皮轻微缺损3例,发生率为6.67％,植床质量一般5例,发生率为11.1％,虹膜损伤4例,发生率为8.89％,前房形成困难3例,发生率为6.67％,术后感染2例,发生率为4.44％,前房积血1例,发生率为2.22％。烧伤前犬眼压为15.70±0.18mmHg,烧伤后眼压为9.48±0.20mmHg,术后第5d眼压为15.34±0.20mmHg,术后第5d与正常犬眼压比较差异不显著(P＞0.05)。烧伤后分别与烧伤前和术后犬眼压相比较差异均极显著(P＜0.01)。(3)1％RAPA滴眼液眼部刺激试验各项得分均为0分,表明1％RAPA滴眼液对眼无刺激性。组织病理切片显示角膜组织正常。生理盐水组角膜出现免疫排斥的平均时间为10.83±2.93d,CSA组角膜出现免疫排斥的平均时间为49.33±9.61d,RAPA组角膜出现免疫排斥的平均时间为56.17±6.34d,至观察期满,生理盐水组无角膜植片存活,CSA组仍有2例角膜植片保持透明,除去采样犬只数,成功率为33.33％,RAPA组仍有5例角膜植片保持透明,成功率为83.33％。各试验组间两两相互比较,具有统计学差异,CSA组、RAPA组分别与生理盐水细比较,角膜发生免疫排斥时间明显延后(P＜0.01),差异性极显著。CSA组与RAPA组比较,角膜发生免疫排斥的时间差异性不显著(P＞0.05)。组织病理学结果显示,术后10d:生理盐水组角膜组织切面厚度增加,上皮细胞层排列紊乱,有溶解、丢失现象,基质层增厚,胶原纤维排列紊乩,后弹力层无明显变化,内皮细胞部分断裂、丢失。CSA组角膜组织厚度与各层结构无明显变化。RAPA组角膜组织结构无明显改变。术后30d:生理盐水组角膜组织切面厚度进一步增加,上皮层溶解现象明显,大量巨噬细胞浸润,基质层内可见毛细血管腔和炎性细胞浸润,后弹力层与相邻结构连接有所脱落,内皮细胞丢失严重。CSA组角膜组织切面有略微增厚,组织结构保持完整。RAPA组角膜组织切面厚度轻微增厚,组织绐构正常。术后60d:生理盐水组角膜组织切面层厚度变薄,上皮细胞层几乎完全溶解,细胞坏死,胞核散落分布,基质层充满大量红细胞,后弹力层脱落,内皮细胞几乎完伞丢失。CSA组角膜上皮表层细胞排列轻度紊乱并有少量丢失,基层内有少量红细胞聚集,后弹力层结构完整,内皮细胞有所丢失和脱落。RAPA组整个角膜组织切面层厚度变化不明显,各层绢织结构均无异常,内皮细胞有极少量丢失。(4)术后10d、30d和60d生理盐水组角膜组织VEGF基因的表达量分别为正常角膜组织VEGF表达量的540.05、978.53、1218.57倍,CSA组为正常角膜组织的240.61、240.10、137.75倍。RAPA组为正常角膜组织的152.96、133.59、35.65倍,差异均极显著(P＜0.01)。术后10d、30d和60dCSA组和RAPA组角膜组织VEGF基因的表达量分别为生理盐水组的0.45、0.25、0.11倍和0.28、0.14、0.03倍,差异均极显著(P＜0.01)。各试验组不同时间点VEGF的表达量分别为:生理盐水组术后30d和60d分别为术后10d的1.81和2.26倍,差异均极显著(P＜0.01)。CSA组术后30d和60d分别为术后10d的0.99和0.57倍,差异性分别为不显著(P＞0.05)和差异性极显著(P＜0.01)。RAPA组术后30d和60d分别为术后10d的0.87和0.23倍,差异性显著(P＜0.05)和差异性极显著(P＜0.01)。
结论:(1)采用1mol/L的。NaoH溶液对角膜进行烧伤效果较好,能建立理想的高危角膜病理模型。(2)CSA滴眼液应用于犬高危穿透性角膜移植术,能够较为显著抑制炎性细胞浸润,对抑制角膜新生血管有一定的效果,并能维持角膜植片正常的组织结构和功能,延迟免疫排斥反应的发生。RAPA滴眼液应用于犬高危穿透性角膜移植手术,能够强有力地抑制角膜组织VEGF基因的表达和炎性细胞的浸润,保持角膜组织结构、功能正常,显著抑制免疫排斥反应的发生和提高角膜植片的存活率。