子宫内膜异位症（Endometriosis,内异症）是指子宫内膜样组织出现在子宫腔及肌层以外的部位,引起不孕、痛经、性交痛等症状,严重影响女性生活质量。其在育龄期妇女中的发病率高且易复发,给社会医疗体系造成巨大负担。尽管内异症的研究持续数十年,但是它的具体发病机制尚不明了。目前的主流学说有“经血逆流学说”、“体腔上皮化生学说”、“免疫学说”等,其中“经血逆流学说”备受推崇,然而任何一种学说都不能完美的解释所有类型的内异症。在“经血逆流学说”的基础上,由国内学者郎景和教授提出的“在位内膜决定论”指出子宫内膜本身的生物学特性决定了内异症的发生。随着测序和组学的发展,越来越多的结果表明内异症患者的在位内膜和正常子宫内膜之间在表观遗传学、RNA水平、蛋白水平上有着明显差异,而这些差异可能造成了子宫内膜细胞功能的不同。如何通过机制的研究,找到对内异症诊断、治疗的新方法是当下研究的热点。长链非编码RNA（long noncoding RNA,lncRNA）是指长度超过200个碱基且不具有蛋白质编码功能的RNA。Lnc RNA可以通过和DNA、RNA、蛋白质的相互作用从转录、翻译和翻译后修饰等层面调控多种重要生理过程。母系表达基因3（maternally expressed gene 3,MEG3）被认为是“抑癌分子”广泛表达于多种正常组织、细胞中,它的表达降低或者缺失可以促进肿瘤的发生和进展。MEG3具有多个转录本,有研究指出不同转录本之间的功能活性有所差异,因此有必要选择一种或者一类转录本进行细致且深入的探索分析。目前尚未见MEG3在内异症中的相关报道,而我们的前期测序结果表明MEG3-210作为MEG3的一个转录本,在内异症患者的在位内膜中表达降低,提示MEG3-210可能与内异症的发生发展相关。半乳糖凝集素-1（Galectin-1）通过糖识别结构域结合β-半乳糖蛋白残基,参与细胞的增殖、迁移、凋亡等。Galectin-1在内异症患者的在位内膜和异位内膜组织中表达增加,且在小鼠内异模型中阻断Galectin-1作用可以缩小病灶并抑制血管生成。丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases,MAPK）通路是介导细胞外信号向细胞内传递的重要信号转导通路。3ˊ,5ˊ-环腺苷酸（3’,5’-cyclic adenosine,c AMP）依赖性的蛋白激酶A（protein kinase A,PKA）是连接钙离子信号通路和c AMP信号通路的中心分子。肌浆网/内质网钙ATP酶(sarcoplasmic reticulum Ca²⁺ATPase 2,SERCA2)通过将细胞内Ca²⁺泵向肌浆网中,控制胞内Ca²⁺浓度,维持细胞内钙平衡。MEG3-210在内异症中的调控机制尚不可知,通过对其调控关系的研究可能有助于探索疾病的发病机制。本研究通过对前期测序数据的再分析,确定MEG3-210在内异症的表达差异,通过对MEG3-210沉默和过表达后检测子宫内膜间质细胞（ESCs）的功能变化探索其对内异症发生发展的作用,而后通过生物信息学分析和分子机制相关实验发现Galectin-1和p38 MAPK及PKA/SERCA2信号通路参与了MEG3-210对ESCs的功能调控,根据通路间的交互作用绘制MEG3-210在内异症中的调控网络图,为内异症的新型诊断和治疗提供分子基础。第一部分MEG3-210在内膜间质细胞中的作用目的:研究MEG3-210在内异症患者和非内异症患者在位内膜组织和间质细胞中的表达水平差异;探索MEG3-210对内膜间质细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响。方法:对5对内异症患者和非内异症患者的子宫内膜组织二代测序结果进行再分析;收集内异症患者在位内膜40例（EU,n=40）,非内异症患者子宫内膜39例（NE,n=39）,分离培养在位内膜间质细胞19例（Eu ESCs,n=19）,对照内膜间质细胞18例（Ne ESCs,n=18）,并进行间质细胞鉴定。q RT-PCR检测MEG3-210在组织和细胞中的表达水平。在Ne ESCs中转染MEG3-210 si RNA来抑制MEG3-210表达,在Eu ESCs中转染MEG3-210过表达质粒来促进MEG3-210表达,采用CCK-8、transwell、流式细胞术检测细胞的增殖、迁移、侵袭和凋亡。结果:1.内异症患者和非内异患者的子宫内膜组织测序共鉴定出26种MEG3转录本,仅MEG3-210和MEG3-202转录本在两组间的差异具有统计学意义。2.MEG3-210在内异症患者的在位内膜组织和间质细胞中表达水平降低3.MEG3-210表达下调后,Ne ESCs迁移、侵袭能力增强,而凋亡减弱,增殖能力无明显影响。4.MEG3-210表达上调后,Eu ESCs迁移、侵袭能力减弱,凋亡增加,增殖能力无明显影响。结论:1.组织验证结果和测序结果一致,测序结果可靠。2.MEG3-210可调控ESCs迁移、侵袭和凋亡,而对增殖无明显作用。3.MEG3-210下调可促进内异症的发生发展第二部分MEG3-210通过p38 MAPK和PKA/SERCA2信号通路调控ESCs迁移、侵袭和凋亡目的:探索参与MEG3-210对子宫内膜间质细胞调控的信号通路。方法:利用生物信息学分析提取与MEG3共表达的基因列表并对其进行KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）富集分析。Western blot验证目标信号通路中相关分子的蛋白水平变化。拯救实验确定该通路参与MEG3-210对ESCs功能的调控。结果:1.根据生信分析结果,与MEG3存在共表达关系的基因可富集出26条主要的信号通路,其中环磷酸腺苷（c AMP）、钙离子和MAPK三条信号通路上富集的基因数最多。2.MEG3-210下调后,p38、ATF2磷酸化水平升高,Bcl-2和MMP2蛋白水平升高,PKA、SERCA2蛋白水平下降。3.联合MEG3-210 si RNA处理,p38 MAPK信号抑制剂SB203580加入后Ne ESCs迁移、侵袭能力部分减弱,凋亡能力恢复。4.联合MEG3-210 si RNA处理,SERCA2过表达后,Ne ESCs迁移、侵袭和抗凋亡能力的均明显抑制。5.联合MEG3-210过表达质粒处理,SERCA2下调后,Eu ESCs的迁移、侵袭能力增强,而细胞凋亡减少。6.SERCA2下调后,p38和ATF2磷酸化水平升高,SB203580加入后,SERCA2蛋白水平下降。结论:1.MEG3-210下调可激活p38 MAPK信号通路并抑制PKA/SERCA2信号。2.p38 MAPK通路的激活和PKA/SERCA2信号的抑制可部分解释MEG3-210下调对ESCs迁移、侵袭和凋亡能力的调控。3.p38 MAPK和PKA/SERCA两条信号通路之间存在交互作用,协同促进内异症的发生发展。第三部分Galectin-1介导MEG3-210对ESCs的作用和机制研究目的:探索与MEG3-210结合的蛋白,以及MEG3-210在内异症中的调控机制方法:构建MEG3-210 RNA探针,通过RNA-pull down质谱分析、RIP、共定位等实验确定Galectin-1与MEG3-210的结合关系。通过western blot确定Galectin-1对p38 MAPK和PKA/SERCA2信号的调控。通过western blot和ELISA检测Galectin-1的表达水平。利用Galectin-1过表达质粒和MEG3-210 si RNA联合转染Ne ESCs后,采用transwell、流式细胞术检测细胞的迁移、侵袭和凋亡。结果:1.RNA-pull down联合质谱分析鉴定出与MEG3-210存在潜在结合的蛋白质。2.MEG3-210探针结合MEG3同时可捕获Galectin-1;Galectin-1抗体沉淀Galectin-1同时可捕获MEG3-210。3.MEG3-210和Galectin-1在ESCs中分布一致。4.Galectin-1过表达后p38磷酸化水平升高,PKA和SERCA2蛋白水平下降。5.Galectin-1在内异症患者的在位内膜组织、间质细胞和血清中表达水平升高。6.Galectin-1下调后,Ne ESCs迁移、侵袭能力下降,凋亡增加。结论:1.MEG3-210与Galectin-1之间存在结合互作关系。2.Galectin-1介导了MEG3-210对ESCs迁移、侵袭和凋亡的调控。3.Galectin-1过表达可激活p38 MAPK信号通路并抑制PKA/SERCA2信号。4.Galectin-1可与其他指标联合用于内异症血清学诊断模型。第四部分MEG3-210和Galectin-1在内异症在体模型中的作用目的:建立内异症动物模型,探索MEG3-210和Galectin-1对在体病灶的作用。方法:利用人源子宫内膜组织和裸鼠构建裸鼠腹腔内异病灶和皮下内异病灶模型,评价病灶的活力,病理检查病灶组织结构。构建sh-MEG3-210腺病毒颗粒,转染组织后观察MEG3-210下调后对在体病灶的作用。活体注射Galectin-1 si RNA,观察Galectin-1下调后对病灶的作用。免疫组化检测病灶中Galectin-1表达水平。结果:1.人源子宫内膜组织可成功构建裸鼠腹腔内异病灶和皮下病灶,但是皮下病灶活性较好。2.腺病毒sh-MEG3-210处理组中的裸鼠病灶体积增加。3.Galectin-1 si RNA联合sh-MEG3-210处理组中的裸鼠病灶体积较sh-MEG3-210处理组中的明显缩小。结论:1.腺病毒能有效地转染子宫内膜组织。2.MEG3-210下调可促进裸鼠皮下内异病灶的生长。3.抑制Galectin-1表达可缩小由MEG3-210下调引起的病灶体积增加。