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目的:用基因重组技术在病毒G蛋白偶联受体(vGPCR)N端融合小鼠钙网蛋白(mCRT),获得真核表达质粒pcDNA3.1(+)-mCRT/vGPCR。将此质粒稳定转染至小鼠黑色素瘤细胞B16-F1中,获得膜上高表达融合蛋白mCRT/vGPCR的B16-F1细胞株,然后体外检测高表达融合蛋白的细胞被吞噬效应。用凋亡药物处理这种细胞株后作为免疫原免疫Balb/C小鼠,研究其激发机体抗肿瘤免疫应答的效用。本研究的目的在于探索抗肿瘤免疫预防和治疗的新途径。方法:(1)应用RT-PCR技术从小鼠黑色素瘤B16-F1细胞总RNA中克隆获得含mCRT ORF全长序列的DNA片段。(2)从质粒pSG5/vGPCR中克隆获得vGPCR ORF全长片段。(3)构建融合基因mCRT/vGPCR并克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+)中。(4)用脂质体转染法将重组质粒转染至小鼠黑色素瘤B16-F1细胞株中,用RT-PCR和Western blotting检测基因的表达,并用流式细胞术和细胞免疫荧光鉴定该融合蛋白在细胞膜上的定位。(5)直接将活的对照B16-F1细胞、转染vGPCR的B16-F1细胞(B16-vGPCR)和转染mCRT/vGPCR的B16-F1细胞(B16-mCRT/vGPCR)接种于Balb/C小鼠皮下,观察肿瘤生长情况。( 6 ) MTT法检测稳定转染质粒pcDNA3.1(+)-vGPCR和pcDNA3.1(+)-mCRT/vGPCR对B16-F1细胞株生长的影响。(7)多胺类似物(BENS)和蒽环类药物(米托蒽醌)分别诱导小鼠黑色素瘤细胞B16-F1和B16-mCRT/vGPCR细胞株凋亡,经皮下注射免疫Balb/C小鼠,免疫8天后,用活的B16-F1皮下接种免疫后的Balb/C小鼠,观察并纪录肿瘤生长状况。(8)ELISA法检测小鼠血清中细胞因子的含量。结果:(1)成功构建了重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)-mCRT/vGPCR,pcDNA3.1(+)-vGPCR。(2)获得膜稳定表达融合蛋白的细胞株B16-mCRT/vGPCR。(3)体外吞噬实验表明,B16-F1细胞膜上高表达融合蛋白mCRT/vGPCR可增强其被吞噬效应。(4)膜上高表达mCRT的B16-F1细胞在小鼠体内生长受抑制,但体外MTT检测发现mCRT的高表达促进B16-F1细胞的生长。(5)动物实验表明,包被有融合蛋白mCRT/vGPCR的凋亡B16-F1细胞作为免疫原可刺激小鼠产生抗同种肿瘤的免疫效应。结论:细胞膜上包被有融合蛋白mCRT/vGPCR的凋亡肿瘤细胞能作为细胞抗原,在动物体内诱导出特异性抗同种肿瘤的免疫杀伤活性。本研究提示了CRT在抗肿瘤研究中的重要的潜在应用价值,为肿瘤预防和治疗提供了新的思路。