肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是我国乃至世界范围内恶性程度最高的肿瘤之一,在肿瘤死亡原因中排名前三位。近年来,HCC发病率和死亡率的上升对我国医疗卫生事业提出了严峻的挑战。10%-20%的HCC患者可以通过切除或移植手术进行治疗,但复发率居高不下,而其他接受化疗的患者,成功率非常低,总之总体生存率较低。在过去十年中,医疗及制药行业虽然大力致力于遏制肝癌发病及进展的各种研究,但仍然没有获得有效的方法。现今当务之急是降低或预防肝癌的发生,控制肝癌的进展。炎症贯穿于肝癌发生发展的过程中。乙型肝炎、丙型肝炎、酒精滥用所致的酒精性肝病、代谢综合征、药物肝损等都是造成肝脏慢性损伤的因素。肝脏慢性损伤进一步发展为慢性炎症,在炎症发展过程中,肝组织、肝细胞坏死,出现炎症造就的恶劣环境,使正常肝细胞无法适应继而死亡,而适应并存活下来的肝细胞则恶性转化为肝癌细胞。恶性转化的这部分细胞的来源是什么,又是什么因素促使它们进一步发展。肝前体细胞(hepatic progenitor cell,HPC)是肝脏内具有自我更新、增殖及多项分化能力的细胞,参与肝脏损伤修复,在肝脏受到疾病影响出现慢性损伤时,HPC被激活(即胆管反应),增殖分化为适应性肝实质细胞、胆管上皮细胞,参与修复。HPC与HCC的发生有紧密的关联,HPC活化能促使HCC的发生,与早期肿瘤复发也有关。有证据证明HCC细胞具有HPC的特性,表达HPC标记物(如CK19)。另外,许多研究表明HPC是肝癌干细胞(CSCs)的起源,因为它们是长寿命的细胞,有足够长的时间累积DNA损伤,增加突变的风险。肝脏损伤、肝内微环境改变、肝脏炎症因子大量分泌情况下,影响肝前体细胞的增殖反应,导致其过程中信号通路失调,使HPC转化为肝癌干细胞(CSCs),导致肝癌发生。我们前期研究也发现脂多糖能抑制HPC的正常分化,通过NF-κB信号通路引起HPC肿瘤转化,并且能促进肝前体细胞CD133的表达。因此,HPC细胞肝癌发生的起始细胞,其激活与炎症微环境密切相关。巨噬细胞(肝内Kupffer细胞)是人体内最大最主要炎症细胞,发挥重要的免疫作用,如清除损伤组织、细胞碎片及病原体等。研究认为巨噬细胞在肝癌的发展和炎症之间起到纽带作用。巨噬细胞具有一定的可塑性,在所处的微环境改变时,可极化为M1和M2两种不同生物学功能的分型,其中M2型主要功能是参组织重塑以及Th2免疫反应,抗原提呈能力较弱,能促进肝癌细胞增殖、血管生成、ECM重塑,协助癌细胞逃逸并转移。肿瘤相关巨噬细胞(tumor associatedmacrophage,TAM)与巨噬细胞M2表面分子及生物学功能相近,在肝癌微环境中起促进肝癌发展的作用。TAM在肿瘤内的浸润程度越深,患者预后就越差。此外也有研究表明T淋巴细胞和B淋巴细胞可间接通过巨噬细胞等作用于肿瘤细胞,进而促进肿瘤的发生和发展。因此,巨噬细胞转化为M2分形可以预示肝癌的发展。Toll样受体是机体重要的免疫应答感受器,该受体在免疫细胞和上皮细胞表面表达。TLR4是Toll样受体(TLR)的成员之一,HPC细胞能高表达TLR4,TLR4可以特异性应答细菌的LPS。此外,前期研究证明,TLR4能促进肝癌细胞的侵袭和迁移。因此,抑制TLR4的表达可能是抑制HCC发生和发展的策略之一。肥胖是一个全球性的健康问题。非酒精性脂肪肝病始于肥胖引起的肝脏中甘油三酯的异常累积,过多的甘油三酯积累能引起脂肪变性。脂肪变性、肝细胞损伤、炎性浸润和/或纤维化同时出现则被称为非酒精性脂肪肝炎,在非酒精性脂肪肝病患者中,有四分之一的患者会进展为非酒精性脂肪肝炎(NASH)。NASH又会进一步发展为肝硬化,最终发展为肝癌。对肥胖的早期控制和预防能降低非酒精性脂肪肝相关肝癌的发病率。八宝丹是一种传统中药,含有牛黄,蛇胆,羚羊角,珍珠,麝香,三七等多种名贵天然成分,具有多重功效,广泛应用于临床各种肝胆疾病。八宝丹多组分在肝脏疾病治疗中具有多功能、多环节、多靶点及多向调节的优势,可以针对肝癌及其他肝病复杂的微环境。我们前期研究表明,八宝丹可以抑制LPS诱导的TLR4的表达,八宝丹可以通过调节炎症微环境保护肝脏治疗慢性肝病。以往的研究都直接针对肿瘤本身进行的,我们设想是否可以通过对炎症的抑制起到对肿瘤发生发展的抑制作用。因此,我们选择八宝丹为抗炎药物,调节改善肝脏炎症微环境,观察其对肝癌发生发展的抑制作用,并研究其可能的机制。为了了解八宝丹对肝癌及脂肪肝的作用及可能的机制,本研究从以下三部分展开:第一部分八宝丹对肝癌发生的影响及机制;第二部分八宝丹对肝癌发展的影响及机制;第三部分八宝丹对非酒精性脂肪肝的影响及机制。第一部分:八宝丹对肝癌发生的影响及机制本部分我们采用DEN诱导的大鼠和LPS诱导的WB-F344细胞为体内外模型,在诱癌的同时,使用八宝丹进行干预,观察了八宝丹对肿瘤发生的影响及可能的机制。通过实验我们发现,八宝丹能抑制DEN诱导的大鼠体内肿瘤生长,抑制DEN引起的大鼠肝脏炎症反应,改善肝功指标,减少肝脏炎性细胞浸润和血清中炎症因子的分泌。同时,八宝丹能抑制DEN诱导引起的肝脏组织内HPC细胞活化相关指标CK-19和SOX-9的表达,抑制胆管反应的发生。另外,通过体外细胞实验,我们发现八宝丹可以抑制LPS诱导的WB-F344细胞克隆形成能力、成球能力和在裸鼠体内的成瘤能力。通过进一步的机制研究发现,在大鼠体内实验和体外细胞实验中,八宝丹能抑制DEN或LPS诱导引起的TLR4的表达增加,并且发现八宝丹能抑制LPS处理的WB-F344细胞中TLR4下游信号分子MyD88和TRAF6的表达增加。本章研究结果提示我们,八宝丹可以通过对TLR4及其下游信号分子MyD88和TRAF6的抑制,降低炎症因子的表达,减少炎症浸润,改善肝脏微环境,减少肝前体细胞活化,从而抑制肝细胞恶性转化降低HCC的发生率。第二部分:八宝丹对肝癌发展的影响及机制本部分,我们仍旧使用DEN诱导的大鼠及LPS诱导的WB-F344细胞为体内外模型,但八宝丹的干预时间设定在肿瘤发生后,观察了八宝丹对肝癌发展的影响及可能的机制。使用DEN诱导大鼠形成肿瘤后,再用八宝丹进行干预,肿瘤数量及大小均显著下降,并且大鼠生存率也比未用八宝丹干预组显著延长,通过肝组织HE染色发现八宝丹对肿瘤形成后的肝脏炎症浸润情况也能显著控制。可见八宝丹具有抑制肿瘤进展的作用。我们进一步考察肝脏组织内巨噬细胞转化情况,发现DEN能引起肝脏内总巨噬细胞增多,这与其引起炎症反应的结果是一致的,而在八宝丹干预后则使巨噬细胞总量下降。接着,我们观察巨噬细胞分化情况发现,肿瘤组织内部巨噬细胞M2的表达显著增多,但用八宝丹干预后M2表达量显著下降。随后我们使用体外分离的原代巨噬细胞验证这一结果,发现LPS诱导巨噬细胞后,CD163的表达增多,说明巨噬细胞M2显著增加;而LPS诱导后用八宝丹干预的细胞则CD163的表达下降,说明巨噬细胞M2显著减少。我们进一步对可能的机制进行研究,发现DEN诱导的肝组织和LPS诱导的巨噬细胞中TLR4的表达显著升高,并且LPS诱导的巨噬细胞中TLR4下游信号分子MyD88和TRAF6也显著升高,而用八宝丹干预后,DEN诱导的肝脏组织或LPS诱导的体外巨噬细胞中TLR4的表达量出现明显下降,并且LPS诱导的巨噬细胞中TLR4下游信号分子MyD88和TRAF6也显著下降。以上结果提示我们八宝丹可能通过对TLR4及其下游信号分子MyD88和TRAF6的抑制从而减少巨噬细胞向M2分型的转化,减少炎症反应及炎症因子分泌,抑制肝癌的进展。第三部分:八宝丹对非酒精性脂肪肝的影响及机制本部分我们采用高脂饮食小鼠建立肥胖小鼠模型,观察八宝丹干预的情况下,对其脂肪肝的影响及可能的机制。我们发现八宝丹能降低高脂饮食引起的小鼠脂肪含量增加、脂肪体积增大及体重增加。八宝丹能改善高脂饮食引起的小鼠肝脏组织脂肪病变、总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)升高、血清高脂症。在改善肝脏功能方面,我们发现八宝丹能降低高脂饮食引起的肝功能指标异常,改善肝脏和血清中炎症因子的表达,改善肝脏纤维化情况,八宝丹能调节小鼠肝脏组织及血清中瘦素水平,使之恢复正常。进一步机制研究发现,抑制脂质合成基因(ACC,SCD-1,CD36,SREBP1-c,LXRα)的表达、激活促进脂肪酸氧化基因AMPK和p-AMPK的表达。研究结果提示,八宝丹可能可以通过调节脂质相关合成基因及脂肪酸氧化基因的表达抑制高脂饮食引起的脂肪肝及系列症状,如脂肪累积、体重增加,肝脏炎症及纤维化反应等。八宝丹能抑制非酒精性脂肪肝的发展,对脂肪肝相关肝癌的发病具有预防意义。综上究结果,我们得到以下结论:1、八宝丹通过对TLR4及其下游信号分子MyD88和TRAF6的抑制,降低炎症因子的表达,减少炎症浸润,改善肝脏微环境,减少肝前体细胞活化,从而抑制肝细胞恶性转化降低HCC的发生率。2、八宝丹能通过对TLR4及其下游信号分子MyD88和TRAF6的抑制从而减少巨噬细胞向M2分型的转化,减少炎症反应及炎症因子分泌,抑制肝癌进展。3、八宝丹能通过调节脂质相关合成基因及脂肪酸氧化基因的表达抑制高脂饮食引起的脂肪肝及系列症状,如脂肪累积、体重增加,肝脏炎症及纤维化反应等,抑制非酒精性脂肪肝的发病,预防非酒精性脂肪病相关肝癌的发生。