研究背景蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)是脑血管病领域内一种常见的疾病,发病率较高,在全球范围内人群发病率为9/10万,部分国家和地区可高达20/100000,SAH发生主要由于各种诱因引起颅内动脉瘤破裂,动脉血从血管内逸出,进入到蛛网膜下腔所致。血液沉积于蛛网膜下腔,脑脊液成分发生改变,从而引起严重的神经功能障碍和并发症。对于诊疗过程中仅进行保守的治疗的SAH患者,发病后6个月内其死亡率高达50-60%。近年来,虽然血管内介入和神经内镜下开颅动脉瘤夹闭等医疗技术不断发展和完善,SAH患者存活率明显提高,但存活者中20-30%仍留有长期的脑功能缺损,特别是认知功能的障碍,给患者家庭和社会整体带来沉重的精神负担和经济负担,因此探索有效的干预时机和靶点,来减轻和改善SAH所引发的长期脑功能损害,是医学界一直以来研究的重点和难点。过去研究观点认为,SAH发生后迟发型脑血管痉挛是导致长期脑功能损害,尤其是认知功能损害的主要原因。如何通过药物对迟发性脑血管痉挛进行有效控制并揭示相关机制也是临床医师和科研人员关注的热点。但近年来多项临床研究显示,控制脑血管痉挛和减轻长期脑功能损害之间并无统计学关联,这一结果对传统理念提出了挑战。鉴于迟发性脑血管痉挛主要继发于SAH发生后72h,以Zhang JH为代表的权威学者将研究关注点转移至SAH更早期阶段,提出了早期脑损伤(early brain injury,EBI)的概念。EBI是指SAH发作72h内、脑血管痉挛发生前所出现的急性脑损伤以及相关病理以及病理生理改变。EBI涉及的机制复杂多样,包括颅内压和脑血流灌注异常、血脑屏障结构和功能损害、神经元的坏死、凋亡、自噬以及炎症反应等病理生理改变。越来越多的研究也证实,EBI所涵盖的病理生理过程与SAH患者的不良预后具有相关性,而通过多种手段来减缓EBI能够有效改善SAH所引发的神经功能损伤以及长期的认知功能障碍。基于以上研究现状,以EBI为中心,深入探讨EBI涉及的病理生理现象,有助于揭示更新的作用机制,发现适当的干预措施来减轻EBI,从而改善SAH患者的长期预后。硫化氢(hydrogensulfide,H2S)目前被认为是继二氧化碳(CO2)、一氧化氮(NO)之后,第三种具有生理调节功能的气体信号分子,不需借助载体和能量,可自由通过血脑屏障和细胞膜磷脂双分子层结构,到达相应部位,并发挥相应的生理调节作用。人体内源性H2S产生主要依赖以下酶的作用:胱硫醚-β-合成酶(cystathionine b-synthase,CBS),胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine γ-lyase,CSE)以及 3-巯基丙酮酸巯基转移酶(3-mercaptopyruvatesulfurtransferase,3-MST),主要以左旋半胱氨酸(L-Cysteine)为底物,最终催化产生H2S气体及其他产物。研究证实,CSE和3-MST广泛表达于胸主动脉、小肠、肾脏等周围组织器官,但在中枢神经系统(central nervous system,CNS)未见明显分布。与此同时,CBS则被证实大量表达于CNS中,特别是星形胶质细胞和小胶质细胞,因此可以认为CNS中H2S的产生和生理功能主要依赖于CBS的数量和活性。学者Kimura等人首次报道了 H2S可以通过促进CNS中谷胱甘肽的产生,有效缓解氧化应激等病理性因素所导致的神经细胞的损伤,从而揭示了 H2S神经保护作用的分子机制。同时,应用H2S可以促进海马区神经干细胞的增殖和分化,有效改善海马区缺氧以及后期缺血-再灌注所引发的神经功能损伤。虽然通过技术手段适量提高内源性H2S的产生对于缺血性脑损伤具有显著的改善效果,但目前关于H2S在SAH中的作用现象和分子调控机制尚未见详细报道,因此进一步开展相关研究,对于推广H2S的实际应用具有重要的现实意义。本课题以“CBS/H2S”作为中心点,采用枕大池注血法建立实验性SAH大鼠模型,以前额叶皮质区(Prefrontal cortex,PFC)作为主要的研究区域,遵循大体病理到组织病理的研究路线,从内源性和外源性两方面深入探讨了 CBS/H2S对SAH后EBI阶段的保护性作用,揭示了 H2S通过保护神经元和突触来实现认知功能改善的相关机制。首先,以硫氢化钠(NaHS)作为外源性H2S的供体来源,通过腹腔给药的方式给予SAH动物模型NaHS溶液,作为体内产生H2S的供体,结合病理结构以及分子指标的改变情况,明确了 H2S能够有效改善EBI的损伤效应,并显著提高SAH大鼠的学习和记忆能力;其次,证实SAH发生后,CBS的表达和生物活性明显降低,给予底物L-Cysteine促进内源性H2S水平的提高,减轻EBI引发的神经元和突触损伤,从而验证了 CBS在CNS中对于H2S产生的关键调控作用的同时明确了 L-Cysteine在SAH中的神经保护作用是通过经CBS作用产生内源性H2S而实现。最后,以病理现象为指导,深入探讨了内、外源性H2S减轻脑损伤并改善认知功能的具体分子机制。本课题研究对SAH发生后脑功能的保护提供了全新的干预手段,对推动临床医疗的发展具有重要的指导价值。第一部分硫化氢对SAH发生后早期脑损伤以及认知功能的改善及机制研究1.1 研究目的:(1)明确SAH发生后EBI阶段的基本病理改变,同时在这一阶段应用外源性H2S供体干预实验性SAH大鼠模型,检测SAH发生后,H2S对以PFC区为代表的脑组织病理损伤的改善性作用。(2)在组织病理的基础上,分析H2S对SAH后脑损伤改善作用的分子机制及相关通路。(3)明确H2S可以通过影响EBI来改善长期认知功能障碍,并阐明相关信号通路的改变。1.2 研究方法(1)构建稳定的实验性SAH大鼠模型选用成年Wistar大鼠,体重在280 g-350 g范围内,采取经典的枕大池注血法,在动物麻醉状态下从自体股动脉抽取动脉血,通过寰枕筋膜穿刺将血液缓慢注入蛛网膜下腔,构建蛛网膜下腔出血动物模型。(2)H2S供体的选择参照多项H2S研究可以发现,NaHS作为一种无机化合物,溶于水即可发生分解反应释放H2S,且毒性小,是一种理想的实验性H2S供体。(3)动物分组方式、H2S供体的选择和动物处死采用随机数法,将实验动物随机分为四组:假手术组(Sham),假手术组+NaHS,SAH组,SAH+NaHS组,其中NaHS作为H2S的直接供体,分别于SAH发生后2h、6h、24h和46h,通过腹腔注射的方式给予SAH大鼠。在SAH后48h,采用异氟烷过量麻醉的方式处死实验动物。(4)H2S对SAH动物大体病理的影响在SAH动物处死之前,观察并记录在此之前各组动物的生存情况,计算死亡率,同时借助神经评分量表,检测各组大鼠神经行为学改变,比较SAH+NaHS组和SAH组之间神经功能差异。(5)H2S改善SAH后神经元凋亡的组织学检测处死实验动物后,部分全脑组织制备石蜡切片,通过HE染色观察各组PFC的水肿和坏死等基本病理表现;对神经元凋亡的检测主要采用以下方法:①透射电镜下直接观测神经元结构,分析病理改变;②TUNEL试剂盒在组织水平定量检测神经元的凋亡情况;③NeuN/cleaved caspase-3荧光双标检测经典凋亡信号分子在神经元中的激活和分布情况。(6)基因和蛋白水平检测H2S调控SAH后神经元凋亡的分子,明确相关信号通路动物处死后,收集PFC分别提取总mRNA和制备蛋白匀浆,采用逆转录PCR技术(RT-PCR)和Western blot检测Bax,Bcl-2等凋亡相关分子在各组动物模型中的表达情况,对于可能激活的信号通路,主要通过Western blot进行检测。(7)实验动物认知功能的检测采用经典的Morris WaterMaze(MWM)平台,通过定位航行实验和空间探索实验两部分来检测各组大鼠的学习和记忆能力,以此作为认知功能的体现,记录相关数据并进行统计学分析。1.3结果(1)与Sham组相比,SAH组大鼠死亡率明显升高,而经NaHS注射干预的SAH大鼠死亡率降低,与SAH组相比具有统计学差异;采用Yamaguchi评分系统对各组大鼠进行神经行为评分,SAH+NaHS组评分总和显著低于SAH组,同时进一步检测脑组织含水量发现,SAH+NaHS组明显减少,提示脑水肿的程度降低,该结果与神经行为评分存在相关关系。(2)SAH发生后,PFC神经元明显坏死,细胞与细胞器的正常结构和形态消失,与凋亡发生密切相关的caspase-3蛋白在神经元中被广泛激活,诱导神经元发生广泛凋亡。应用NaHS后可以抑制SAH大鼠神经元中caspase-3的激活,降低其表达水平从而抑制细胞凋亡的发生。(3)SAH后,激活ERK1/2以及Akt通路的关键信号分子活化受到明显抑制,其下游的细胞凋亡效应分子Bax与Bcl-2表达发生改变,Bax/Bcl-2比值显著上升,而应用NaHS后,SAH大鼠神经元ERK和Akt的磷酸化水平显著增高,Bax/Bcl-2比值的降低,发挥抗凋亡效应,但调控Akt信号通路的重要分子PTEN未见显著改变。(4)在MWM实验定位航行训练部分,各组大鼠的潜伏期随着训练天数的增加均有缩短,但经NaHS干预后的SAH大鼠,其潜伏期相比于SAH大鼠缩短更为显著;在空间探索实验中,经NaHS干预后的SAH大鼠找到潜在平台象限的时间较普通SAH大鼠更短,在此区域停留徘徊的时间更长,提示NaHS干预的SAH大鼠,其学习和记忆能力明显优于普通SAH大鼠。同时RT-PCR和Western blot检测显示,SAH大鼠PFC脑组织内环磷腺效应元件结合蛋白(cAMP-response element binding protein,CREB)和脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)活化水平下降,导致与认知功能密切相关的CREB-BDNF信号通路激活受抑制,而NaHS则可提高CREB与BDNF的活化,从而为SAH大鼠在MWM实验中的学习和以及能力的改善提供了分子信号层面的理论解释。1.4结论(1)H2S可以通过减轻脑水肿、减少神经元坏死和凋亡等方式,减轻SAH引发的EBI程度,降低死亡率,改善神经行为障碍,提高生存质量。(2)H2S发挥神经保护效应的分子机制是通过上调Akt/ERK信号通路活化水平,并且影响Bax、Bcl-2等凋亡相关分子的表达。从而逆转SAH引发的神经细胞凋亡,发挥神经保护作用,但调控Akt信号通路的PTEN表达未受H2S干预影响,提示H2S可能通过影响其他机制来调控相关信号通路。(3)H2S可以显著改善SAH大鼠的学习和记忆能力,提示对认知功能具有保护作用,这种作用不仅是通过减轻神经细胞损伤,同时可以通过激活CREB-BDNF信号通路来实现。第二部分左旋半胱氨酸通过CBS/H2S系统对SAH后早期脑损伤和突触损伤的改善及机制研究2.1研究目的(1)探讨L-Cysteine对SAH发生后EBI阶段脑水肿和神经细胞凋亡的影响。(2)揭示SAH发生后CBS酶的活性以及数量表达的改变,同时在明确L-Cysteine具有神经保护作用的基础上,借助CBS酶抑制剂,研究L-Cysteine是否是通过被CBS的分解代谢产生H2S从而在SAH中发挥神经保护作用。(3)以突触作为反映神经功能的基本研究单位,探讨SAH发生对突触结构的损伤情况,在此基础上,明确L-Cysteine干预对突触结构的保护作用,并阐明相关的分子改变。2.2实验方法(1)实验动物分为 5 组:Sham 组,Sham+L-Cysteine 组,SAH 组,SAH+L-Cysteine 组,SAH+L-Cysteine+AOAA 组,其中 L-Cysteine 于 SAH 后 30 分钟通过立体定位注入右脑室,同时给予腹腔注射AOAA,完成各模型组的制备。(2)SAH后48h,采用改良Garcia评分系统对各组大鼠进行神经行为评估,使用过量异氟烷吸入法进行处死,取部分动物全脑做脑含水量测定,检测脑水肿程度。(3)采用免疫组织化学技术观察各组大鼠PFC区CBS的表达,同时利用酶活性试剂盒以及亚甲蓝法,检测该区域脑组织CBS酶活性以及H2S含量变化。(4)利用TUNEL检测试剂盒对各组大鼠PFC神经元凋亡进行检测;免疫荧光双标法对神经元中活化的caspase-3进行标记,作为凋亡激活的指标,在组织病理层面进行探讨。(5)采用RT-PCR和Western blot技术对凋亡相关效应分子进行检测,明确L-Cysteine的抗凋亡作用。(6)利用透射电镜直接观察PFC区突触的数目及形态变化,同时借助RT-PCR和Western blot检测synaptophysin、PSD95两种突触后蛋白,作为间接指标反映突触的功能改变,最后检测CREB-BDNF信号通路的表达。2.3实验结果(1)组织病理染色证实,单独应用L-Cysteine和AOAA并不引起脑组织明显的损伤,改变神经元正常的结构和形态,提示L-Cysteine和AOAA的应用具备安全性。(2)正常情况下CBS广泛存在于PFC区胶质细胞中,底物L-Cysteine的加入并不影响表达的数量,但可以显著提高酶活性程度,增加H2S的产出;而SAH发生后,CBS表达显著下降,酶活性降低,H2S含量减少;通过L-Cysteine干预的SAH大鼠,不仅增加H2S的产量,同时发现CBS的表达和活性均发生上调,而CBS特异性阻断剂AOAA则可以阻断L-Cyeteine对CBS的影响。(3)L-Cysteine可以减轻SAH后脑水肿程度,减少皮质区神经元的坏死和排列结构紊乱,与改善神经行为障碍的现象具有一致性。(4)我们发现L-Cysteine可以通过被CBS分解产生内源性H2S显著减少神经元凋亡,从而发挥脑保护作用,这与我们前期研究发现的H2S抗凋亡现象相一致。(5)L-Cysteine可以改善SAH引发的突触的病理性改变,上调突触数量,同时在分子和基因层面提高关键突触后蛋白的表达水平,减轻突触的损伤。2.4结论(1)L-Cysteine可以发挥神经保护作用,主要通过CBS酶分解产生H2S,减少脑水肿和神经元凋亡从而降低SAH后EBI对脑功能的损伤。(2)在病理状态下,L-Cysteine作为底物,具有上调CBS酶表达和活性的功能,促进H2S的产生,提示CBS与L-Cysteine之间存在内在的正反馈调节关系。(3)L-Cysteine 可以减轻SAH引发的突触损伤,同时能够通过上调突触后蛋白的表达实现减轻突触结构损伤,揭示了 H2S对于SAH后认知功能保护的一种潜在机制。