猪支原体肺炎（Mycoplasma pneumoniae of swine, MPS）是由猪肺炎支原体（Mycoplasma hyoneumoniae, Mhp）引起的一种猪的慢性呼吸道疾病,该病广泛存在于世界各地。我国对该病的血清流行病学监测显示,超过95%的猪场均为Mhp血清阳性。然而目前的疫苗免疫效果较差,研发具有免疫保护效果的Mhp疫苗就成为Mhp研究的核心内容之一。病原菌的外膜蛋白和分泌蛋白在病原菌的致病过程中通常能够与宿主细胞直接接触,触发宿主的免疫应答反应。因此,外膜蛋白和分泌蛋白通常作为疫苗抗原的候选靶标。本课题通过生物信息学方法预测了Mhp的部分外膜蛋白和分泌蛋白,并将这些进行了原核表达和纯化,这为后续的抗原筛选提供了筛选靶标。1.Mhp168₂18、Mhp168₃66、Mhp168₄77蛋白的生物信息学分析目的：通过生物信息学分析,预测Mhp168₂18、Mhp168₃66、Mhp168₄77的亚细胞定位。方法：将Mhp168菌株的mhp168₂18、mhp168-366和mhp168₄77碱基序列及编码蛋白的氨基酸序列与Mhp232/J株、Mhp7422株和Mhp7448株的基因序列及氨基酸序列进行BLAST比对,分析三个基因核苷酸序列及相应蛋白氨基酸序列的保守性。利用SignalP4.1软件和LipoP1.0软件预测三个蛋白的信号肽序列；利用DAS软件分别预测三个蛋白的跨膜区；利用CELLO version2.5预测三个蛋白的亚细胞定位。结果：mhp168₂18基因的碱基序列保守性在98%以上,编码蛋白的氨基酸序列保守性约为99%,含有信号肽序列,可能存在8个跨膜区,可能为外膜蛋白或分泌蛋白；mhP168₃66基因的碱基序列保守性在98%以上,编码蛋白的氨基酸序列保守性为96%-98%,不含有信号肽序列,存在4个跨膜区,可能为外膜蛋白或分泌蛋白；mhp168₄77基因的碱基序列保守性在98%以上,编码蛋白的氨基酸序列保守性超过99%,不含有信号肽序列,存在4个跨膜区,可能为外膜蛋白或周质蛋白。结论：根据生物信息学分析结果,Mhpl68₂18.Mhp168₃66.Mhp168₄77均可能为外膜蛋白,可作为疫苗候选蛋白抗原。2.mhp168₂18基因分段表达与蛋白纯化目的：mhp168₂18基因分段原核表达,获得高纯度具有良好天然构象的重组目的蛋白。方法：将mhp168₂18基因分为4段,分别命名mhp168₂18-1、mhp168₂18-2、 mhp168₂18-3和mhp168₂18-4。将不存在编码色氨酸的TGA的mhp168₂18-1、 mhp168₂18-3和mhp168₂18-4基因片段直接连接pGEX-6p-2载体；将存在编码色氨酸的TGA的mhp168₂18-2基因片段连接pMD19-T载体后TGA突变为TGG,再将突变后的mhp168₂18-2基因片段连接pGEX-6p-2载体。将4个连接pGEX-6p2载体的重组质粒转化大肠杆菌XL-1感受态细胞,经0.2mmol/L IPTG诱导表达,后用谷胱甘肽Beads纯化得到融合蛋白,利用PreScission protease酶切纯化蛋白,经SDS-PAGE检测蛋白表达情况与纯化效果。结果：经测序表明mhp168₂18-2基因片段突变成功,融合GST标签的Mhp168₂18-1.Mhp168₂18-2.Mhp168₂18-3和Mhp168₂18-4重组蛋白能够以可溶形式表达,大小分别为41kDa.59kDa.40kDa和58kDa,且这些重组蛋白均能被谷胱甘肽Beads纯化。Mhp168₂18-2重组蛋白可被PreScission protease酶切,获得不携带GST标签的33kDa的Mhp168₂18-2目的蛋白。结论：Mhp168₂18-1、Mhp168₂18-2、Mhp168₂18-3和Mhp168₂18-4蛋白能以具有良好天然构象的可溶形式在大肠杆菌XL-1中表达,并被谷胱甘肽Beads纯化。Mhp168₂18-2重组蛋白能够被PP酶切去GST标签,得到Mhp168₂18-2可溶性目的蛋白。3.mhp168₃66与mhp168₄77基因的原核表达及纯化目的：mhp168₃66、mhp168₄77基因原核表达,获得高纯度具有良好天然构象的重组目的蛋白。方法：将mhp168₃66与mhp168₄77基因分别连接到pMD19-T克隆载体,将编码色氨酸的mhp168₃66基因中的4个TGA及mhp168₄77基因中3个TGA均突变为TGG,连接pGEX-6p-2表达载体并转化E.coli XL-1感受态细胞,经0.2mmol/L IPTG诱导表达,后用谷胱甘肽Beads纯化得到融合蛋白,利用PreScission protease酶切纯化蛋白,经SDS-PAGE检测蛋白表达情况与纯化效果。结果：经测序表明mhp168₃66与mhp168₄77基因片段突变成功,融合GST标签的Mhp168₃66和Mhp168₄77重组蛋白能够以可溶形式表达,大小分别为45.1KDa和59.8KDa。结论：Mhpl68₃66、Mhp168₄77蛋白能以可溶形式在大肠杆菌XL-1中表达,并被谷胱甘肽Beads纯化。4.6个蛋白免疫活性的研究目的：检测6个蛋白的免疫原性和反应原性。方法：将纯化后的融合蛋白分别免疫小鼠,并以纯化后融合蛋白为包被抗原建立间接ELISA检测方法,检测各个蛋白抗血清的抗体效价。利用Mhp日性血清对纯化后融合蛋白进行Western-blot试验检测。结果：间接ELISA检测结果Mhp168₂18-1、Mhp168₂18-2、Mhp168₂18-3、 Mhp168₂18-4、Mhp168₃66和Mhp168₄77蛋白的抗血清具有较高的抗体效价,其P/N值的平均值分别是2.74、2.34、2.83、2.40、2.67和2.37。Western-blot试验结果显示Mhp168₂18-1、Mhp168₂18-2、Mhp168₃66和Mhp168₄77能够和Mhp阳性血清发生反应,Mhp168₂18-3和Mhp168₂18-4不能和Mhp阳性血清发生反应。结论：Mhp168₂18-1、Mhp168₂18-2、Mhp168₃66和Mhp168₄77具有良好的免疫原性和反应原性。