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目的:急性白血病是一类源于骨髓造血干/祖细胞的恶性克隆性疾病,死亡率较高。其中,急性髓细胞白血病(Acute myeloid leukemia,AML)是成年人常见的白血病类型,约占急性白血病的60%-70%。AML的治疗目前临床仍主要依赖于联合化疗,然而白血病细胞对化疗药物耐药是白血病复发难治的关键,也是临床上化疗失败的最重要原因。miRNA是一类长度为19-25个核苷酸的内源性非编码RNA,在遗传学上高度保守。它通过与靶基因3’非翻译序列的特异性结合在转录后水平调控靶基因的表达,与肿瘤细胞对化疗药物的敏感性密切相关。miR-199a-5p是机体的一个重要miRNA,其功能涉及心肌肥大、骨骼发育、肿瘤的发生和肿瘤细胞耐药等方面。有研究显示miR-199a-5p低表达与肝细胞癌对化疗药物耐药有关。另有研究表明miR-199a-5p转基因小鼠经雷帕霉素处理提高心肌细胞自噬活性能够显著降低心肌细胞肥大的水平。这些研究提示miR-199a-5p在调控肿瘤细胞多药耐药以及自噬活性中发挥重要的作用。细胞自噬是真核细胞内广泛存在的一种高度保守的生命现象,是细胞在应激条件下通过自我分解受损蛋白质和细胞器以维持细胞内环境的稳态和基因组稳定性的一种重要方式。诸多研究表明,对肿瘤细胞使用化疗药物可以诱发自噬反应,大多数肿瘤细胞中自噬作为保护性机制参与多药耐药的产生和维持。文献报道急性白血病初发患者、复发难治患者、完全缓解患者的骨髓单个核细胞的自噬活性存在显著差异,提示自噬参与调节急性白血病多药耐药。综上,为了研究miR-199a-5p和自噬活性在AML耐药中的调控作用,本研究以AML患者与AML耐药和敏感细胞株为研究对象,检测miR-199a-5p的表达水平及自噬活性,探索二者对白血病多药耐药的调控作用及相关信号转导通路,进一步寻找miR-199a-5p调控自噬和耐药的功能性靶基因。本研究阐明了miR-199a-5p在AML耐药中的生物学作用,为临床多药耐药白血病的治疗提供新的靶点。研究方法:1、采用实时定量RT-PCR方法对16例复发难治和7例完全缓解的急性髓细胞白血病患者的骨髓单个核细胞miR-199a-5p表达进行检测。2、采用实时定量RT-PCR方法对急性髓细胞白血病细胞株K562、HL60及其耐药细胞株K562/ADM、HL60/ADM中miR-199a-5p表达进行检测。3、K562/ADM和K562细胞中采用lipo2000转染miR-199a-5p的mimic和inhibitor,验证转染效率,CCK-8法检测细胞增殖率。4、Western blot方法检测K562和K562/ADM细胞中自噬相关蛋白LC3-II/I和Beclin1的表达。5、3-MA预处理K562和K562/ADM细胞后,采用Western blot检测细胞中LC3-II/I和Beclin1的表达变化。6、3-MA与阿霉素联合处理K562/ADM细胞,采用CCK-8法检测细胞增殖率。7、K562/ADM和K562细胞中采用lipo2000转染miR-199a-5p的mimic和inhibitor,Western blot方法检测LC3-II/I,Beclin1和P62蛋白表达。8、采用细胞转染方法上调和下调miR-199a-5p表达,mGFP-RFP-LC3串联荧光腺病毒法在荧光显微镜下观察K562和K562/ADM细胞中LC3荧光。9、采用细胞转染的方法上调和下调miR-199a-5p表达后,Western blot检测细胞中磷酸化和非磷酸化的AKT,mTOR以及P70S6K1蛋白表达。10、生物信息学预测miR-199a-5p调节自噬的下游靶基因。11、采用实时定量RT-PCR和Western blot方法检测K562和K562/ADM细胞中DRAM1基因和蛋白的表达。12、采用细胞转染的方法上调和下调miR-199a-5p表达,实时定量RT-PCR和Western blot方法检测K562和K562/ADM细胞中DRAM1基因和蛋白表达。13、双荧光素酶报告基因实验验证miR-199a-5p与DRAM1 3’UTR区直接结合。14、采用siRNA法下调K562/ADM细胞中DRAM1基因表达,Western blot检测LC3-II/I的表达。15、采用siRNA法下调K562/ADM细胞中DRAM1基因表达,CCK-8法检测细胞的增殖率。结果:1、采用RT-PCR方法对16例复发难治AML患者(RR1-RR16)和7例完全缓解AML患者(CR1-CR7)骨髓单个核细胞miR-199a-5p的表达进行检测。结果显示,与完全缓解期患者相比,复发难治AML患者miR-199a-5p呈低表达趋势。2、miR-199a-5p在急髓白血病耐药细胞K562/ADM、HL60/ADM中的表达显著低于其敏感细胞K562、HL60(P<0.05)。3、miR-199a-5p转染效率验证:在K562/ADM细胞中,与转染阴性对照组相比较,转染miR-199a-5p mimic的细胞株miR-199a-5p表达水平显著升高(P<0.05);在K562细胞中,与转染阴性对照组相比,转染miR-199a-5p inhibitor的细胞株中miR-199a-5p表达水平明显下降(P<0.05)。CCK-8实验显示,K562/ADM细胞转染miR-199a-5p mimic后,细胞增殖活性下降;K562细胞转染miR-199a-5p inhibitor后,细胞增殖活性明显升高(P<0.05)。4、基础状态下,K562/ADM中LC3-II/I和Beclin1的表达均高于K562细胞;进一步加入不同剂量阿霉素诱导后,两组细胞中LC3-II/I和Beclin1表达均升高,此效应在K562/ADM中更为显著和迅速(P<0.05)。5、K562和K562/ADM细胞加入3-MA处理后,细胞中LC3-II/I和Beclin1蛋白表达均显著下降(P<0.05)。6、CCK-8实验显示,3-MA预处理后,K562/ADM细胞的增殖活性明显下降(P<0.05)。7、miR-199a-5p表达下调后,K562细胞中LC3-II/I和Beclin1表达增强,P62表达减弱;miR-199a-5p表达上调后,K562/ADM细胞中LC3-II/I和Beclin1表达减弱,P62表达增强(P<0.05)。8、K562细胞miR-199a-5p表达下调后,荧光显微镜下观察LC3黄色及红色荧光颗粒数量增加,自噬增强;K562/ADM细胞miR-199a-5p表达上调后,黄色及红色荧光颗粒数量明显减少,自噬减弱。9、K562细胞中miR-199a-5p表达下调后,p-AKT、p-mTOR、p-P70S6K1表达增强;K562/ADM细胞中miR-199a-5p表达上调后,p-AKT、p-mTOR、p-P70S6K1表达减弱(P<0.05)。10、生物信息学预测DRAM1为miR-199a-5p下游靶基因。11、K562/ADM细胞中DRAM1在基因和蛋白水平表达均高于K562细胞(P<0.05)。12、K562/ADM转染miR-199a-5p mimic后,DRAM1在mRNA和蛋白水平较未转染组和转染阴性对照组明显下降(P<0.05);相反,K562细胞转染miR-199a-5p inhibitor后,DRAM1在mRNA和蛋白水平的表达显著升高(P<0.05)。13、双荧光素酶报告基因检测实验证实miR-199a-5p mimic可显著降低DRAM1的野生型3’UTR质粒的荧光强度,突变该结合位点可阻断此现象的发生。14、在K562/ADM中,通过siRNA降低DRAM1表达,LC3-II/I蛋白表达明显下降(P<0.05)。15、在K562/ADM中,通过siRNA降低DRAM1表达,细胞增殖活性下降(P<0.05),K562/ADM对阿霉素的敏感性增强。结论:1、miR-199a-5p在急髓白血病耐药细胞株以及复发难治急髓白血病患者骨髓标本中呈低表达。miR-199a-5p表达与细胞对化疗药物的敏感性相关。2、与K562细胞相比,K562/ADM细胞在一般情况下即表现较高的基础自噬活性;采用阿霉素处理后,两组细胞都表现出自噬活性增强以应对环境变化,K562/ADM自噬活性增强更为显著。3-MA能够抑制白血病细胞的自噬活性。抑制自噬后白血病耐药细胞K562/ADM对化疗药物的敏感性增强。3、miR-199a-5p高表达抑制白血病细胞的自噬活性。该效应是由于抑制自噬的启动,而非阻断自噬流。PI3K/AKT/mTOR/P70S6K1信号转导通路参与miR-199a-5p对急髓白血病耐药细胞自噬的调控。DRAM1是miR-199a-5p调控急性髓细胞白血病自噬和耐药的功能性靶基因。