疟疾是由感染疟原虫引起的一类传染病，在全世界人群中具有很高的发病率和致死率。接种疫苗被认为是控制传染性疾病最行之有效的措施，有效的疟疾疫苗能降低发病率、病死率和疾病的传染。红外期是设计预防性疟疾亚单位疫苗的理想时期[1]，因为红外期不会出现临床症状，阻断红外期的发育能从源头控制疟原虫的感染和防止疟疾的复发。在过去的几十年里，大量的疟疾候选疫苗已经在研发和测试，然而，目前尚无有效的疟疾红外期亚单位疫苗问世。因此，继续研发新型有效的疟疾疫苗仍然十分重要。HSP（heat shock protein, HSP）具有诱导DC成熟和促进抗原交叉递呈的能力，并且还是一种重要的免疫佐剂和免疫递送系统；进一步研究发现HSP中的Gp96活化机体免疫的能力主要位于N末端（NTD），Gp96结合多肽能被DC有效地交叉递呈到MHCⅠ，并活化CD8+T细胞[2]；另外，环子孢子蛋白（circumsporozoites protein, CSP）已被证实是减毒子孢子疫苗的主要保护性抗原[3]，SYVPSAEQI是约氏疟原虫环子孢子蛋白CSP中CD8+T细胞特异的表位肽[4]。因此，本研究旨在构建Gp96_NTD-CSP重组疟疾DNA疫苗，并观察其诱导小鼠产生保护性免疫及其机制。根据我们对现有减毒子孢子疫苗的保护性免疫机制的认识，设计了大量的亚单位疫苗，但是均未能获得高效、安全的亚单位疫苗，其主要原因在于我们对减毒子孢子的保护性免疫机制的认识还不够深入。迄今为止，最有效的红外期疟疾疫苗仍然是辐射减毒子孢子疫苗[5,6]和遗传减毒子孢子疫苗[7]。与辐射减毒子孢子相比，遗传减毒子孢子减毒程度稳定，用量较小，免疫效果更好，可作为探讨疟疾疫苗保护性免疫机制的重要模型。至今为止，只有基于靶向敲除基因UIS3[7],UIS4[8], P52[9],P36p[10], FabB/F[11]或者SAP1[12]的六种遗传减毒子孢子。其中，FabB/F是原核型的Ⅱ型脂肪酸合成（FASⅡ）途径中表达关键酶的基因，敲除FabB/F后，FAS II缺乏的疟原虫发育停止在肝期晚期，但对红内期疟原虫裂殖子的复制、子孢子蚊期发育和肝期早期的发育没有影响。FabB/F敲除的P. yoelii子孢子免疫小鼠后，不仅能诱导小鼠产生红前期的完全保护性免疫，而且对红内期也有保护作用[13]。因此，本研究构建P. yoelii FabB/F-/-遗传减毒子孢子，并用其免疫小鼠，观察其减毒程度及提供保护性免疫的能力，以确定遗传减毒子孢子免疫模型的建立。构建遗传减毒子孢子免疫模型可为进一步探讨影响小鼠产生保护性免疫的因素及其机制奠定基础。一、GP96_NTD-CSP重组DNA疟疾疫苗诱导小鼠产生保护性免疫的研究1、构建用于小鼠免疫的pFLAG CMV8gp96_NTD-CSP、pFLAG CMV8gp96_NTD-SYVPSAEQI、pFLAG CMV8CSP、pFLAG CMV8gp96_NTD重组质粒PCR方法扩增获得gp96_NTD及CSP片段，以及通过退火、复性获得编码CSP中CD8+T细胞特异的表位肽SYVPSAEQI的双链DNA片段，克隆至pFLAG-CMV8载体构建pFLAG CMV8gp96_NTD（P-NTD）与pFLAG CMV8CSP （P-CSP）重组质粒，再以pFLAG CMV8gp96_NTD质粒为模板构建pFLAG CMV8gp96_NTD-CSP （P-NTD-CSP）、pFLAG CMV8gp96_NTD-SYVPSAEQI （P-NTD-SYV）重组质粒，酶切鉴定并测序。2、pFLAG CMV8gp96_NTD-CSP等核酸疫苗重组质粒在真核表达细胞Cos-7细胞中的表达检测去内毒素提取pFLAG CMV8gp96_NTD、pFLAG CMV8gp96_NTD-CSP、 pFLAGCMV8CSP等核酸疫苗重组质粒后，采用Lipofactamine2000TM将质粒转染至真核表达细胞株Cos-7中；以兔抗gp96多克隆抗体和兔抗环子孢子蛋白CSP多克隆抗体间接免疫荧光染色法观察基因gp96_NTD和CSP的表达情况。结果发现，蛋白gp96_NTD和CSP主要表达在真核表达细胞Cos-7的细胞浆及细胞膜上。3、GP96_NTD-CSP重组DNA疟疾疫苗诱导小鼠的保护性效果检测定量PCR检测小鼠肝脏内疟原虫特异的18srRNA即肝脏虫荷显示，与WT、NaCl和pFLAG-CMV8免疫组相比，P-NTD-CSP、P-NTD-SYV、P-CSP和P-NTD质粒免疫小鼠的肝脏虫荷则有明显的下降，其中以P-NTD-CSP免疫组小鼠肝脏虫荷最低（p<0.05）。子孢子攻击感染后第6天查原虫血症，P-NTD-CSP组小鼠从出现原虫血症开始，一直处在比较低的水平，而且比较早就清除了体内的疟原虫。结果表明GP96_NTD-CSP重组DNA疟疾疫苗能诱导小鼠产生一定的保护性免疫反应，免疫组小鼠显著抵御野生子孢子的攻击。4、GP96_NTD-CSP重组DNA疟疾疫苗诱导小鼠产生保护性免疫的机制研究ELISA法检测血清中抗CSP特异抗体总IgG的水平，结果显示，P-NTD-CSP免疫与放射减毒子孢子免疫均能诱导小鼠产生较高的抗CSP特异抗体；ELISPOT实验显示，P-NTD-CSP、P-NTD-SYV、P-CSP和P-NTD免疫均能活化CSP特异的CD8+T细胞，但以pFLAG CMV8gp96_NTD-CSP免疫小鼠产生CSP特异的CD8+T细胞的频率最高，与WT、NaCl，其他质粒免疫组有显著性差别。结果表明，GP96_NTD-CSP重组DNA疟疾疫苗诱导小鼠产生保护性免疫可能通过诱导小鼠CSP特异抗体和CSP特异的CD8+T细胞发挥作用的。二、约氏疟原虫BY265株遗传减毒子孢子的构建1、成功获得用于同源重组的各片段Fab5UTR和Fab3UTR提取约氏疟原虫BY265株基因组，PCR方法扩增获得用于与疟原虫BY265株基因组同源重组的Fab5UTR和Fab3UTR片段。进行T/A克隆，便于后期进行PCR扩增及测序，测序结果证实，用于同源重组的片段Fab5UTR和Fab3UTR在扩增中无突变发生，可用于下一步的同源重组片段的融合。2、成功获得用于同源重组的融合片段Fab5UTR+hDHFR+3UTR采用重叠PCR的方法成功融合并扩增用于同源重组的片段Fab5UTR+hDHFR+3UTR，并采用酚氯仿抽提的方法进行纯化，电泳及测序结果表明，同源重组片段Fab5UTR+hDHFR+3UTR在扩增中无突变发生，可用于与疟原虫基因组的同源重组。3、遗传减毒子孢子的构建、克隆及鉴定采用同源重组策略，约氏疟原虫FabB/F被hDHFR插入并替换，经乙胺嘧啶筛选后的亲代血用于克隆并筛选FabB/F敲除的红内期疟原虫。采用PCR的方法进行鉴别野生型和单克隆的遗传减毒型疟原虫，结果发现，用鉴定FabB/F-/-P.yoelii BY265的引物FabTFw1/Rv1、FabTFw2/Rv2和hDHFR Fw/Rv分别能在10个中的4个单克隆疟原虫株基因组中扩出大小约796bp、619bp和1628bp的条带。结果说明P. yoelii FabB/F敲除的遗传减毒子孢子已构建成功。总之，本课题构建的GP96_NTD-CSP重组DNA疫苗可能通过诱导小鼠CSP特异抗体和CSP特异的CD8+T细胞，一定程度上抵御疟原虫子孢子的攻击。为了进一步探讨减毒子孢子诱导小鼠产生完全保护性免疫的机制，本研究构建了P. yoelii FabB/F-/-的遗传减毒子孢子，并且下一步将通过免疫观察减毒子孢子能否诱导小鼠产生完全抵抗野生型子孢子能力，并探讨诱导完全保护的主要的免疫机制。这为深入研究红外期疫苗的保护性免疫机制和疟疾亚单位疫苗的研制奠定了重要的基础。