膀胱癌为泌尿生殖系统中较为常见的恶性肿瘤。据美国癌症协会统计,2016年,全美新发膀胱癌将达76,960例,新增死亡病例为16,390例。膀胱癌的首发症状为无痛性血尿,约有75%的患者,在首诊时被诊断为非肌层浸润性移行上皮癌。在接受首次标准化的经尿道膀胱肿瘤切除术后(TURBT),约有70%的患者将会在5年内复发。因此,对于膀胱癌的患者,在术后需经历严格复查程序,包括定期的膀胱镜检查,以及对于高肿瘤分级患者术后的膀胱内辅助化疗和免疫治疗。这使得患者在承受疾病的痛苦同时,也背负了巨大的经济负担。有关膀胱肿瘤的分子生物学机制一直是科学研究的重点。目前,受到关注的研究方向包括9号染色的缺失,成纤维细胞生长因子受体3(FGFR3)的点突变,以及抑癌基因P53和Rb的相关改变。然而肿瘤的发生是多因素共同作用的结果,其机制也比人们想象的复杂。在2011年,2组大规模的基因相关性分析(GWAS)研究表明,SLC14A1基因很可能与膀胱肿瘤的发生发展密切相关。SLC14A1基因属于溶质转运家族,该基因全长为30kb,位于18号染色体18q12.1-18q21.1。SLC14A1基因编码尿素转运蛋白B(UT-B)。该蛋白的主要功能,为在渗透梯度的作用下,辅助尿素的跨细胞膜转运。同时,UT-B蛋白也是红细胞上的一种血型抗原。目前,共有2种UT-B蛋白亚型,分别为UT-B1和UT-B2。UT-B1(389AA,约为43KDa)首先在人体骨髓红系造血细胞中被克隆出,随后被定位于全身多个组织器官。而UT-B2(445AA,约为43-54KDa)则在牛的肠道系统中率先被发现,其在氨基端由于接入第3外显子的开放阅读框,相比于UT-B1具有额外的56个氨基酸。目前,仅在人脑的尾状核内发现了 UT-B2的mRNA,在近期的一项研究中,UT-B2 mRNA也被定位于膀胱组织。目前尚无发现人体内UT-B2蛋白的报道。相关的功能性研究表明,在肾脏组织内的UT-B蛋白主要位于肾直血管降段的内皮细胞上,该蛋白对于维持内髓处的渗透梯度起到十分重要的作用。在肾外组织中,UT-B蛋白的功能,与防止尿素在细胞内蓄积密切相关。在膀胱内的尿液中,其尿素浓度为血液中尿素浓度的20-100倍。UT-B蛋白表达于尿路上皮的全层。在UT-B基因敲除小鼠中,其尿路上皮细胞内呈现出严重的凋亡及DNA损伤。在2014年,Li等研究发现,UT-B蛋白在膀胱肿瘤中表达下降,而且其趋势与肿瘤分级成负相关。综上,UT-B蛋白在膀胱癌中的表达下降,很可能导致尿素在尿路上皮中蓄积,从而诱发癌变。目的:探究在膀胱肿瘤中导致SLC14A1基因及其编码的UT-B蛋白异常表达的机制研究对象及方法:本研究共包含了 62例膀胱肿瘤样本,以正常人体组织Western Blot蛋白膜、膀胱组织及其总cDNA和尿路上皮细胞系(NHU)作为对照。62例膀胱肿瘤样本包括10例临床TURBT标本、2株膀胱肿瘤细胞(T24,5637)、3例膀胱癌总RNA、1例膀胱癌总cDNA及46例膀胱肿瘤和正常组织配对组织芯片标本。首先在mRNA水平,我们通过RT-PCR技术来探究UT-B1 mRNA及UT-B2 mRNA在上述组织中的表达情况,用qPCR对上述样本进行了相对定量,并对所有PCR产物进行Sanger法测序。同时,在克隆出UT-B1、UT-B2及肿瘤中的UT-B蛋白转录本后,将其构建入真核细胞表达载体pcDNA3中,用于后续的基因体外表达研究。在蛋白质水平,采用Western Blot及免疫组化染色,来探究UT-B蛋白在正常膀胱组织与膀胱肿瘤组织中的差异性表达。在翻译后修饰水平,我们首先将含目的基因的pcDNA3质粒,转染入HEK293细胞中以作为对照。同时,我们将上述目的基因克隆到pGH19质粒中,采用蟾蜍卵细胞显微注射技术,对上述研究中的UT-B蛋白的转运功能进行了研究。采用凝集素沉降实验及PNGase F酶消化实验,来研究UT-B蛋白的糖基化修饰在膀胱肿瘤中的改变。采用细胞表面生物素化实验,来分析不同转录本所编码的UT-B蛋白,在细胞膜上的表达情况。结果:1.UT-B蛋白在正常膀胱组织中的表达。在mRNA水平,UT-B2 mRNA及UT-B1mRNA均表达于正常膀胱组织中。在蛋白质水平,正常膀胱组织中的UT-B在Western Blot中表现为37-50KDa的较宽条带。2.UT-B在膀胱肿瘤组织中的表达及序列分析。在mRNA水平,膀胱肿瘤中的UT-B转录本表达下降,其中UT-B2mRNA,表达率为 56.2%。UT-B1 表达率为 87.5%。在UT-B1mRNA中,有71.4%在第4外显子开放阅读框内存在长度为24个碱基的序列缺失。此含有碱基缺失的UT-B1被命名为AUT-B1。在蛋白质水平,膀胱肿瘤中的UT-B蛋白表达下降,在Western Blot中表现为在38KDa附近的单一条带。免疫组化结果提示,UT-B蛋白在膀胱癌中的表达量和肿瘤的分级呈负相关。在46例组织中,UT-B在低级别肿瘤中的染色得分为1.61 ± 0.53(n=25),在高级别肿瘤中,其染色得分为0.52 ±0.43(n=21)。3.肿瘤特异性△UT-B1序列在细胞膜上的表达和功能情况。将含UT-B1、UT-B2及AUT-B1编码序列的真核表达质粒转染入HEK 293细胞后,对其细胞表面膜蛋白用生物素进行标记,Western结果显示,△UT-B1相比于UT-B1更易在细胞膜表面聚集(4.31倍,n=4,p<0.01)。蟾蜍卵细胞通水实验表明,△UT-B1的转运能力显著低于UT-B2 及 UT-B1。4.膀胱肿瘤中UT-B蛋白表现为低唾液酸化。在本项实验中,应用UT-B1、UT-B2及△UT-B1转染的HEK 293细胞作为对照,主要研究对象为新鲜的TURBT组织。首先,脂筏分离试验表明,脂筏中糖基化的UT-B2蛋白表现为38-50KDa的较宽条带,在去糖基化酶的作用下表现为38KDa的单一条带。脂筏中糖基化的UT-B1表现为38KDa的条带,去糖基化后呈现为28KDa。△UT-B1及膀胱肿瘤中的UT-B在脂筏中的表达形式及去糖基化形式与UT-B1相同。凝集素沉降实验表明,UT-B2,UT-B1和△UT-B1蛋白在293细胞中,其糖链结构以N-乙酰葡萄糖胺及唾液酸为主,而膀胱肿瘤组织中所分离出的UT-B蛋白表现为低唾液酸化,与碱基缺失相互独立。结论:首先在mRNA水平,UT-B 1及UT-B2 mRNA均表达于正常的膀胱组织中。在膀胱肿瘤组织中,UT-B2mRNA的表达率明显下降(56.2%)。UT-B1 mRNA可以表达于大多数的膀胱肿瘤组织中(87.5%),而这其中有70%的UT-B1 mRNA含有长度为24个碱基的序列缺失。在蛋白质水平,UT-B蛋白在正常膀胱组织中表现为38-50KDa连续致密条带,而在膀胱癌中,UT-B蛋白则表现为位于38KDa附近的较窄条带,且表达水平下降,其下降的程度与肿瘤的分级成负相关。在翻译后修饰水平,含有碱基缺失的△UT-B1于HEK 293细胞中更易于在细胞表面聚集,但其生理功能显著低于UT-B1及UT-B2。同时,膀胱肿瘤中的UT-B蛋白表现为低唾液酸化,与碱基缺失互为独立事件。综上,我们发现UT-B蛋白在膀胱癌中的异常表达,主要表现为UT-B1 mRNA碱基序列缺失及UT-B1蛋白低唾液酸化,此二者相互独立。碱基缺失的UT-B1蛋白虽然有较强的上膜能力,但其功能较弱。这一结论,为SLC14A1基因及其产物UT-B蛋白成为膀胱肿瘤研究的靶点提供了新的科学依据。