论文部分内容阅读
目的：从细胞自噬角度探讨槲皮素调控膝骨关节炎（KOA）软骨细胞外基质代谢及炎症反应的作用机制。方法：提取软骨细胞、传代培养，及用Ⅱ型胶原蛋白（Collagen Ⅱ）免疫荧光染色鉴定原代细胞；将脂多糖（LPS）诱导的软骨细胞分为对照组（不做任何处理）、模型组(10 μg·mL-1 LPS处理48 h)、槲皮素低剂量组、槲皮素中剂量组、槲皮素高剂量组(10 μg·mL-1 LPS处理48 h+50、100、150 μmol·mL-1槲皮素处理24 h)。CCK-8法检测LPS(2.5、5、7.5、10、12.5 μg·mL-1)对软骨细胞不同时间（24、48、72 h）增殖的抑制作用；槲皮素(50、100、150、200 μmol·mL-1)对LPS诱导的软骨细胞不同时间（12、24、48 h）增殖的影响；蛋白免疫印迹法（Western blot，WB）检测微管相关蛋白1轻链3B（LC3II）和泛素结合蛋白p62（p62）表达。用3-甲基腺嘌呤（3-MA）干预LPS诱导的软骨细胞，分为对照组（不做任何处理）、模型组(10 μg·mL-1 LPS)、槲皮素组(模型组+100 μmol·mL-1槲皮素)、3-MA组(模型组+100 nmol·mL-1 3-MA)、3-MA+槲皮素组(模型组+100 nmol·mL-1 3-MA+100 μmol·mL-1槲皮素)，先用LPS处理48h后，3-MA处理2 h，再用槲皮素干预24 h。酶联免疫吸附法（ELISA）检测IL-1β、TNF-α含量；WB法检测基质金属蛋白酶-13（MMP-13）、金属蛋白酶组织抑制因子1（TIMP1）蛋白表达。结果：Collagen Ⅱ免疫荧光鉴定结果示，所提取的细胞符合软骨细胞特征；CCK8法筛选LPS最佳造模浓度为10 μg·mL-1、48 h，槲皮素最佳浓度为100 μmol·mL-1、24 h；WB结果示，与对照组比较，模型组LC3II表达显著降低（P<0.01），P62表达显著升高（P<0.01），与模型组比较，槲皮素低剂量组、槲皮素中剂量组、槲皮素高剂量组LC3II表达显著升高（P<0.01），其槲皮素中剂量组最显著，p62表达显著降低（P<0.01），其槲皮素中剂量组最显著；模型组MMP-13表达较对照组显著升高（P<0.05），TIMP1表达显著降低（P<0.01）；与模型组比较，槲皮素组、3-MA+槲皮素组MMP-13表达显著降低（P<0.05，P<0.01），其中槲皮素组最显著，TIMP1表达显著升高（P<0.01），其中槲皮素组最显著。倒置显微镜下观察软骨细胞形态学改变结果示，槲皮素可恢复受损的软骨细胞形态；CCK8检测各组细胞增殖结果示，与对照组相比，模型组软骨细胞增殖明显被抑制（P＜0.01）；与模型组比较，槲皮素组、3-MA+槲皮素组软骨细胞增殖显著升高（P<0.01），其中槲皮素组最显著；ELISA检测结果示，模型组IL-1β、TNF-α含量较对照组显著升高（P<0.01）；与模型组比较，槲皮素组、3-MA+槲皮素组IL-1β、TNF-α含量显著降低（P<0.05，P<0.01），其中槲皮素组降低最显著。结论：槲皮素可促进LPS诱导的软骨细胞增殖，调控软骨细胞外基质合成与代谢平衡，抑制炎症反应，恢复软骨细胞功能，其机制可能与槲皮素激活细胞自噬有关。