【摘 要】
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目的 建立用于绿色荧光标记的重组人偏肺病毒(GFP-rhMPV)空斑形成滴度测定方法.方法 基因组中插入绿色荧光蛋白基因的hMPV全序列cDNA质粒和主要蛋白质表达质粒转入细胞293T后
【机 构】
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重庆医科大学附属儿童医院儿研所P,中国农业科学院哈尔滨兽医研究所人兽共患病实验室,重庆医科大学附属儿童医院肾脏免疫科
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目的 建立用于绿色荧光标记的重组人偏肺病毒(GFP-rhMPV)空斑形成滴度测定方法.方法 基因组中插入绿色荧光蛋白基因的hMPV全序列cDNA质粒和主要蛋白质表达质粒转入细胞293T后获得感染性重组hMPV.GFP-rhMPV在Vero-E6细胞中连续传代提升病毒滴度并保存.将等倍稀释的重组病毒液接种常规制备的Vero-E6细胞单层,用含或不含胰酶的低熔点琼脂精凝胶覆盖细胞,孵育一定时间后,采用荧光显微镜下计数荧光空斑数和抗原抗体蓝斑形成法计算病毒滴度.结果 感染后3 d,荧光显微镜下GFP-rhMPV可在低熔点琼脂糖凝胶覆盖层下形成分界较为清晰的绿色荧光集落,接种后3 d荧光空斑相对独立,便于计数.蓝斑形成法在感染后第5天蓝斑较大,易观察.此前拯救获得的GFP-rhMPV在宿主细胞Vero-E6中的复制滴度可达1×106 PFU以上.结论 成功建立了GFP-rhMPV的空斑形成实验滴度定量检测方法,为hMPV的致病机制、防治手段研究奠定了基础.
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