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摘 要:本文通过出发菌株Nocardia.sp.163摇瓶发酵96h后分别向发酵液中间歇加入丙烯腈和催化生成高浓度丙烯酰胺分别对菌丝的毒害和耐受作用以及发酵液中残存菌丝涂布平板置于18℃低温培养成单菌落,筛选到一株比出发菌株Nocardia.sp.163相对腈水合酶酶活提高了76%的24号优良菌株。该菌株在催化腈水合生成丙烯酰胺的反应中,产酰胺酶酶活性比出发菌株降低了近50%;丙烯酰胺水溶液的电导率比出发菌株降低了45%,反应次数提高了3.33次,丙烯酰胺放料浓度提高了5.93%。
关键词:诺卡氏菌 腈水合酶 丙烯酰胺耐受 菌种选育
中图分类号:TQ925 文献标识码:A 文章编号:1674-098X(2011)04(b)-0006-03
腈水合酶(nitrile hydratase,NHase)是生物催化法生产丙烯酰胺(acrylamide,AM)的催化剂,能催化丙烯腈(acrylonitrile,AN)水合生成丙烯酰胺。该酶的活性大小是微生物法生产丙烯酰胺的关键技术。丙烯酰胺(AM)是精细化工的重要产品之一,是合成水溶性线型高分子聚合物——聚丙烯酰胺(PAM)系列产品的唯一单体,PAM广泛用于石油、地质、冶金、造纸、纺织、水处理等经济建设的各个领域,号称“百业助剂”。 在工业生产中,当丙烯酰胺达到一定浓度后,腈水合酶的催化速率显著降低,丙烯酰胺浓度很难有进一步提高,终浓度通常为300～400 g/L[3,4]。要得到丙烯酰胺晶体,还要通过蒸气浓缩及结晶才能得到98%的含量,生产中得到的结果表明,提高丙烯酰胺溶液百分比浓度可减少蒸气用量。所以提高腈水合酶菌的丙烯酰胺耐受性有重要的意义。同时,丙烯酰胺水溶液中电导率的高低直接影响丙烯酰胺生产的效益。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 产腈水合酶的菌
Nocardia.sp.163,为本实验室保藏。
1.1.2 培养基
1.1.2.1 斜面和平板培养基(g/L)
葡萄糖10.0;K2HPO40.5;KH2PO40.50;NaC1 1.0;MgSO4.7H2O,0.5;酵母浸膏3.0;琼脂,20.0。
1.1.2.2 发酵培养基(g/L)
葡萄糖20.0;K2HPO4 0.50;KH2PO40.50;MgSO4.7H2O0.50;谷氨酸1.0;脲7.0;酵母浸膏5.0;CoCl2.6H2O,10mg/L;调pH值7.50。以上培养基成分除酵母浸膏和琼脂是生化试剂外,其余皆为分析纯。
1.2 方法
1.2.1 菌体发酵培养
将Nocardia.sp.163斜面菌种菌块接于盛有30mL发酵培养基的150mL摇瓶中进行发酵培养,摇床转速240r/min,温度为28℃。培养96h后得到具有腈水合酶活性的发酵液。
1.2.2 提高腈水合酶产生菌对底物丙烯酰胺浓度耐受性的方法
将接种Nocardia.sp.163斜面菌种的摇瓶培养96 h后,分别在培养96h、98h、100h、102h、104h、106h、108h、110h、112h和114h分别向摇瓶发酵液中加入含量99%定量丙烯腈2mL继续摇瓶培养,菌体产生腈水合酶催化丙烯腈生成丙烯酰胺作用2h后,分别在培养98h、100h、102h、104h、106h、108h、110h、112h、114h和116h分别从摇瓶中取出2mL发酵液,其中1mL为分别检测发酵液中丙烯酰胺浓度和腈水合酶活性,另1mL发酵液稀释后涂布在固体平板上,置于28℃恒温培养96h分别进行平板菌落计数和残存百分率。同时摇瓶96h在未加丙烯腈前取发酵液2mL,分别进行平板菌落计数和丙烯酰胺浓度及腈水合酶活性检测,以作对照处理。
1.2.3 低温驯化的方法
1)从上述已连续6次分别加2mL丙烯腈摇瓶培养110h摇瓶中取出发酵液1mL,稀释10倍液分别涂布在15皿平皿固体培养上,然后将已涂布15皿平皿分别置于12℃、14℃、16℃、18℃、20℃培养箱中进行低温培养处理,每种温度3皿,培养96h。
2)再将5种低温培养平板上长出稀少菌落分别接种斜面培养基上,置于28℃恒温培养箱恒温培养96h至菌苔生长丰满。
3)将不同低温处理单菌落斜面菌块接于盛有30mL发酵培养基的150mL摇瓶中进行发酵培养,摇床转速240r/min,温度为28℃.培养96h后分别检测不同低温处理摇瓶发酵液中腈水合酶活性液。
1.2.4 丙烯酰胺水溶液的制备
准确称取40g晶体丙烯酰胺,置100mL 容量瓶中,加蒸馏水至刻度,配制成40%丙烯酰胺水溶液,置冰箱保存。
1.2.5 检测方法
1.2.5.1 腈水合酶活性的测定
腈水合酶活性测定:准确移取1mL发酵液,19mL磷酸缓冲液于150mL具塞三角瓶中,把三角瓶放入恒温水浴,开启振荡,温度恒定在28℃,加入1000μLAN,用秒表控制,准时反应5min,用4moL／LHCL200μL中止反应,用气相色谱仪测定反应液中生成的丙烯酰胺含量。
1.2.5.2 酰胺酶的测定
取8个150mL具塞三角瓶,编号后,依次移入4mL磷酸缓冲液,再依次向三角瓶中各移入等量的发酵液10mL,放入28℃恒温水浴振荡器中。加入40%丙烯酰胺水溶液1mL进行反应,30min后,用6N HCL终止反应,按气相色谱法测定丙烯酸的量,即为丙烯酰胺酶的含量。
1.2.5.3 电导率的测定
水合反应实验装置见图1,主要装置是三口烧瓶(5000mL),内置发酵液细胞粒子与水的比例为1∶8,水浴控制反应温度10℃左右,搅拌为100r/min。缓慢流加丙烯腈,底物浓度控制在4%,当产物浓度达到25%～30%左右,终止反应,取样用电导仪测产物丙烯酰胺水溶液电导率。方法见Q/SN K002- 2000,利用此装置测出驯化株和对照株不同细胞粒子水合反应生成丙烯酰胺的电导率。
2 结果与分析
2.1 不同丙烯酰胺浓作用下菌体存活率和腈水合酶活性变化的检测结果
不同丙烯酰胺浓作用下菌体存活率和腈水合酶活性变化的检测结果见表1。
随着丙烯酰胺的积累,摇瓶培养液中活菌体数逐渐减少,特别是摇瓶培养到108～112h,菌体的存活率大幅下降,摇瓶发酵液中的丙烯酰胺浓度达到16%,发酵液活菌存活率为0.0021%,在摇瓶培养液中丙烯酰胺浓度达到18.67%,发酵液活菌存活率为零。
2.2 耐高浓度丙稀酰胺和不同低温培养处理菌落斜面摇瓶发酵结果
从Nocardia.sp.163菌株在含有16%丙烯酰胺浓度培养到112h取发酵液稀释10倍液涂布固体培养基平皿上分别置于不同低温培养处理,所获得的28个残存菌落斜面分别进行摇瓶发酵96h后,其发酵液中的腈水合酶活性检测结果见表2。
由表2可知,平皿在不同低温培养下残存所得28株菌的摇瓶发酵所产腈水合酶活性均高于Nocardia.sp.163菌株在通常28℃培养下摇瓶发酵所产腈水合酶活性,说明腈水合酶活性与其腈水合酶菌在斜面培养的温度有关联。在18℃、16℃、20℃、14℃和12℃低温处理培养的菌株摇瓶发酵所腈水合酶活性平均酶活单位(万μ/mg)分别比对照正常28℃培养的摇瓶发酵所腈水合酶活性平均酶活单位分别提高了58.24%、47.27%、45.45%、43.72%和44.14%。其中18℃培养所得的24号菌株和22号菌株的摇瓶腈水合酶酶活单位分别为1422万μ/mg和1314万μ/mg,比对照处理Nocardia.sp.163菌株的摇瓶腈水合酶酶活单位分别提高了76%和63%。
2.3 Nocardia.sp.163与24号菌株摇瓶发酵酰胺酶的检测结果
Nocardia.sp.163与24号菌株摇瓶发酵酰胺酶的检测结果见表3。
由表3可知,24菌株产酰胺酶酶活性只有Nocardia.sp.163菌株的50.77%。由于酰胺酶的存在,易导致丙烯酰胺水解形成丙烯酸,不利于丙烯酰胺的生产,故24号菌株更有利于丙烯酰胺的生产。
2.4 Nocardia.sp.163与24号菌株号电导率的测定结果
由于Nocardia.sp.163和24号菌株都能产生酰胺酶(AA),导致生产中丙烯酰胺部分水解形成丙烯酸,影响产品质量。按照丙烯酸电导率的测定方法, Nocardia.sp.163和24号菌株水解丙烯酰胺产生丙烯酸的电导率见表4。
由表4可知,24号菌株的平均电导率为834,相比Nocardia.sp.163下降了近45%。由于在生产中电导率的高低直接影响到精制中的过料速率,电导率高,过料速率变慢,电导率越低,过料速率越快。且酶活越高,反应速率越快,有利于反应釜的利用率,同时若电导率低则精制过料速率加快,反应釜中的丙烯酰胺对发酵菌丝体的伤害减少,这样有利于增加反应次数。24号菌株分别具有产腈水合酶酶活较高、酰胺酶和电导率较低,由于产丙烯酸降低,使得丙烯腈单耗均明显下降。
2.5 Nocardia.sp.163和24号菌株在水合反应中的试验结果
Nocardia.sp.163和24号菌株在水合反应中的反应次数及其放料的平均浓度检测结果见表5。
从表5可以看出,24号菌株菌株发酵后投入水合反应平均反应次数比Nocardia.sp.163多3.33次,放料浓度高5.93%。说明24号菌株与Nocardia.sp.163菌株相比具有较高的丙烯酰胺耐受性。
3 结论
1)Nocardia.sp.163菌株摇瓶发酵96h后,分别通过发酵液中的高浓度(16%)丙烯酰胺耐受性和该发酵液涂布在固体平板上置于18℃低温培养处理,从长出的残存菌落斜面再分别经摇瓶发酵和检测发酵液中腈水合酶酶活性筛选,获得优良的24号菌株, 腈水合酶酶活性达到1422万μ/mg,比出发Nocardia.sp.163菌株的腈水合酶酶活性807万μ/mg提高了76%。
2)通过检24号菌株和Nocardia.sp.163菌株发酵液中丙烯酰胺酶活性检测和电导率(us/cm)检测,丙烯酰胺酶活性24号菌株仅是Nocardia.sp.163菌株的50.77%,电导率24号菌株比Nocardia.sp.163菌株降低了近45%。
3)通过24号菌株和Nocardia.sp.163菌株的水合反应试验,24号菌株水合反应反应次数增加3.33次,丙烯酰胺放料浓度由原来的26.07%提高到32.0%,提高了5.93%。
参考文献
[1] Kobayashi M,Shimizu S.Nitrile Hydrolases.Curr.Opin.Chem.Bio1.,2000,4(1):95～102.
[2] Liu Ming(刘铭),Jiao Peng(焦鹏).Cao Zhu’an(曹竹安).Advances of Nitrile Hydratase used in Bioconversion forAcrylamide.Journal of Chemical Industry and Engineering(China)(化工学报),2001,52(10):847～852.
[3] Yamada H.Kobayashi^,L Nitfile Hydratase and Its ApplicationtO IndustriaI Production of Acrylamid~ Biosci. Biotech.Biochem.1996.60 (9): 1391～1400.
[4] Nagasawa T.Shimizu H。Yamada H. The Superiority of the Third-generation Catalyst,Rhodococcus rhodochrous j1 Nitrile Hydratase. for Industrial Production of Acrylamide. App1.Microbio1. Biotechno1.1993,40:189～195.
“本文中所涉及到的图表、公式、注解等请以PDF格式阅读”
关键词:诺卡氏菌 腈水合酶 丙烯酰胺耐受 菌种选育
中图分类号:TQ925 文献标识码:A 文章编号:1674-098X(2011)04(b)-0006-03
腈水合酶(nitrile hydratase,NHase)是生物催化法生产丙烯酰胺(acrylamide,AM)的催化剂,能催化丙烯腈(acrylonitrile,AN)水合生成丙烯酰胺。该酶的活性大小是微生物法生产丙烯酰胺的关键技术。丙烯酰胺(AM)是精细化工的重要产品之一,是合成水溶性线型高分子聚合物——聚丙烯酰胺(PAM)系列产品的唯一单体,PAM广泛用于石油、地质、冶金、造纸、纺织、水处理等经济建设的各个领域,号称“百业助剂”。 在工业生产中,当丙烯酰胺达到一定浓度后,腈水合酶的催化速率显著降低,丙烯酰胺浓度很难有进一步提高,终浓度通常为300～400 g/L[3,4]。要得到丙烯酰胺晶体,还要通过蒸气浓缩及结晶才能得到98%的含量,生产中得到的结果表明,提高丙烯酰胺溶液百分比浓度可减少蒸气用量。所以提高腈水合酶菌的丙烯酰胺耐受性有重要的意义。同时,丙烯酰胺水溶液中电导率的高低直接影响丙烯酰胺生产的效益。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 产腈水合酶的菌
Nocardia.sp.163,为本实验室保藏。
1.1.2 培养基
1.1.2.1 斜面和平板培养基(g/L)
葡萄糖10.0;K2HPO40.5;KH2PO40.50;NaC1 1.0;MgSO4.7H2O,0.5;酵母浸膏3.0;琼脂,20.0。
1.1.2.2 发酵培养基(g/L)
葡萄糖20.0;K2HPO4 0.50;KH2PO40.50;MgSO4.7H2O0.50;谷氨酸1.0;脲7.0;酵母浸膏5.0;CoCl2.6H2O,10mg/L;调pH值7.50。以上培养基成分除酵母浸膏和琼脂是生化试剂外,其余皆为分析纯。
1.2 方法
1.2.1 菌体发酵培养
将Nocardia.sp.163斜面菌种菌块接于盛有30mL发酵培养基的150mL摇瓶中进行发酵培养,摇床转速240r/min,温度为28℃。培养96h后得到具有腈水合酶活性的发酵液。
1.2.2 提高腈水合酶产生菌对底物丙烯酰胺浓度耐受性的方法
将接种Nocardia.sp.163斜面菌种的摇瓶培养96 h后,分别在培养96h、98h、100h、102h、104h、106h、108h、110h、112h和114h分别向摇瓶发酵液中加入含量99%定量丙烯腈2mL继续摇瓶培养,菌体产生腈水合酶催化丙烯腈生成丙烯酰胺作用2h后,分别在培养98h、100h、102h、104h、106h、108h、110h、112h、114h和116h分别从摇瓶中取出2mL发酵液,其中1mL为分别检测发酵液中丙烯酰胺浓度和腈水合酶活性,另1mL发酵液稀释后涂布在固体平板上,置于28℃恒温培养96h分别进行平板菌落计数和残存百分率。同时摇瓶96h在未加丙烯腈前取发酵液2mL,分别进行平板菌落计数和丙烯酰胺浓度及腈水合酶活性检测,以作对照处理。
1.2.3 低温驯化的方法
1)从上述已连续6次分别加2mL丙烯腈摇瓶培养110h摇瓶中取出发酵液1mL,稀释10倍液分别涂布在15皿平皿固体培养上,然后将已涂布15皿平皿分别置于12℃、14℃、16℃、18℃、20℃培养箱中进行低温培养处理,每种温度3皿,培养96h。
2)再将5种低温培养平板上长出稀少菌落分别接种斜面培养基上,置于28℃恒温培养箱恒温培养96h至菌苔生长丰满。
3)将不同低温处理单菌落斜面菌块接于盛有30mL发酵培养基的150mL摇瓶中进行发酵培养,摇床转速240r/min,温度为28℃.培养96h后分别检测不同低温处理摇瓶发酵液中腈水合酶活性液。
1.2.4 丙烯酰胺水溶液的制备
准确称取40g晶体丙烯酰胺,置100mL 容量瓶中,加蒸馏水至刻度,配制成40%丙烯酰胺水溶液,置冰箱保存。
1.2.5 检测方法
1.2.5.1 腈水合酶活性的测定
腈水合酶活性测定:准确移取1mL发酵液,19mL磷酸缓冲液于150mL具塞三角瓶中,把三角瓶放入恒温水浴,开启振荡,温度恒定在28℃,加入1000μLAN,用秒表控制,准时反应5min,用4moL／LHCL200μL中止反应,用气相色谱仪测定反应液中生成的丙烯酰胺含量。
1.2.5.2 酰胺酶的测定
取8个150mL具塞三角瓶,编号后,依次移入4mL磷酸缓冲液,再依次向三角瓶中各移入等量的发酵液10mL,放入28℃恒温水浴振荡器中。加入40%丙烯酰胺水溶液1mL进行反应,30min后,用6N HCL终止反应,按气相色谱法测定丙烯酸的量,即为丙烯酰胺酶的含量。
1.2.5.3 电导率的测定
水合反应实验装置见图1,主要装置是三口烧瓶(5000mL),内置发酵液细胞粒子与水的比例为1∶8,水浴控制反应温度10℃左右,搅拌为100r/min。缓慢流加丙烯腈,底物浓度控制在4%,当产物浓度达到25%～30%左右,终止反应,取样用电导仪测产物丙烯酰胺水溶液电导率。方法见Q/SN K002- 2000,利用此装置测出驯化株和对照株不同细胞粒子水合反应生成丙烯酰胺的电导率。
2 结果与分析
2.1 不同丙烯酰胺浓作用下菌体存活率和腈水合酶活性变化的检测结果
不同丙烯酰胺浓作用下菌体存活率和腈水合酶活性变化的检测结果见表1。
随着丙烯酰胺的积累,摇瓶培养液中活菌体数逐渐减少,特别是摇瓶培养到108～112h,菌体的存活率大幅下降,摇瓶发酵液中的丙烯酰胺浓度达到16%,发酵液活菌存活率为0.0021%,在摇瓶培养液中丙烯酰胺浓度达到18.67%,发酵液活菌存活率为零。
2.2 耐高浓度丙稀酰胺和不同低温培养处理菌落斜面摇瓶发酵结果
从Nocardia.sp.163菌株在含有16%丙烯酰胺浓度培养到112h取发酵液稀释10倍液涂布固体培养基平皿上分别置于不同低温培养处理,所获得的28个残存菌落斜面分别进行摇瓶发酵96h后,其发酵液中的腈水合酶活性检测结果见表2。
由表2可知,平皿在不同低温培养下残存所得28株菌的摇瓶发酵所产腈水合酶活性均高于Nocardia.sp.163菌株在通常28℃培养下摇瓶发酵所产腈水合酶活性,说明腈水合酶活性与其腈水合酶菌在斜面培养的温度有关联。在18℃、16℃、20℃、14℃和12℃低温处理培养的菌株摇瓶发酵所腈水合酶活性平均酶活单位(万μ/mg)分别比对照正常28℃培养的摇瓶发酵所腈水合酶活性平均酶活单位分别提高了58.24%、47.27%、45.45%、43.72%和44.14%。其中18℃培养所得的24号菌株和22号菌株的摇瓶腈水合酶酶活单位分别为1422万μ/mg和1314万μ/mg,比对照处理Nocardia.sp.163菌株的摇瓶腈水合酶酶活单位分别提高了76%和63%。
2.3 Nocardia.sp.163与24号菌株摇瓶发酵酰胺酶的检测结果
Nocardia.sp.163与24号菌株摇瓶发酵酰胺酶的检测结果见表3。
由表3可知,24菌株产酰胺酶酶活性只有Nocardia.sp.163菌株的50.77%。由于酰胺酶的存在,易导致丙烯酰胺水解形成丙烯酸,不利于丙烯酰胺的生产,故24号菌株更有利于丙烯酰胺的生产。
2.4 Nocardia.sp.163与24号菌株号电导率的测定结果
由于Nocardia.sp.163和24号菌株都能产生酰胺酶(AA),导致生产中丙烯酰胺部分水解形成丙烯酸,影响产品质量。按照丙烯酸电导率的测定方法, Nocardia.sp.163和24号菌株水解丙烯酰胺产生丙烯酸的电导率见表4。
由表4可知,24号菌株的平均电导率为834,相比Nocardia.sp.163下降了近45%。由于在生产中电导率的高低直接影响到精制中的过料速率,电导率高,过料速率变慢,电导率越低,过料速率越快。且酶活越高,反应速率越快,有利于反应釜的利用率,同时若电导率低则精制过料速率加快,反应釜中的丙烯酰胺对发酵菌丝体的伤害减少,这样有利于增加反应次数。24号菌株分别具有产腈水合酶酶活较高、酰胺酶和电导率较低,由于产丙烯酸降低,使得丙烯腈单耗均明显下降。
2.5 Nocardia.sp.163和24号菌株在水合反应中的试验结果
Nocardia.sp.163和24号菌株在水合反应中的反应次数及其放料的平均浓度检测结果见表5。
从表5可以看出,24号菌株菌株发酵后投入水合反应平均反应次数比Nocardia.sp.163多3.33次,放料浓度高5.93%。说明24号菌株与Nocardia.sp.163菌株相比具有较高的丙烯酰胺耐受性。
3 结论
1)Nocardia.sp.163菌株摇瓶发酵96h后,分别通过发酵液中的高浓度(16%)丙烯酰胺耐受性和该发酵液涂布在固体平板上置于18℃低温培养处理,从长出的残存菌落斜面再分别经摇瓶发酵和检测发酵液中腈水合酶酶活性筛选,获得优良的24号菌株, 腈水合酶酶活性达到1422万μ/mg,比出发Nocardia.sp.163菌株的腈水合酶酶活性807万μ/mg提高了76%。
2)通过检24号菌株和Nocardia.sp.163菌株发酵液中丙烯酰胺酶活性检测和电导率(us/cm)检测,丙烯酰胺酶活性24号菌株仅是Nocardia.sp.163菌株的50.77%,电导率24号菌株比Nocardia.sp.163菌株降低了近45%。
3)通过24号菌株和Nocardia.sp.163菌株的水合反应试验,24号菌株水合反应反应次数增加3.33次,丙烯酰胺放料浓度由原来的26.07%提高到32.0%,提高了5.93%。
参考文献
[1] Kobayashi M,Shimizu S.Nitrile Hydrolases.Curr.Opin.Chem.Bio1.,2000,4(1):95～102.
[2] Liu Ming(刘铭),Jiao Peng(焦鹏).Cao Zhu’an(曹竹安).Advances of Nitrile Hydratase used in Bioconversion forAcrylamide.Journal of Chemical Industry and Engineering(China)(化工学报),2001,52(10):847～852.
[3] Yamada H.Kobayashi^,L Nitfile Hydratase and Its ApplicationtO IndustriaI Production of Acrylamid~ Biosci. Biotech.Biochem.1996.60 (9): 1391～1400.
[4] Nagasawa T.Shimizu H。Yamada H. The Superiority of the Third-generation Catalyst,Rhodococcus rhodochrous j1 Nitrile Hydratase. for Industrial Production of Acrylamide. App1.Microbio1. Biotechno1.1993,40:189～195.
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