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目的建立可同时区分3-epi 25-羟基维生素D3[3-epi 25(OH)D3]、25-羟基维生素D3[25(OH)D3]和25-羟基维生素D2[25(OH)D2]的改良超高效液相色谱串联质谱法(UPLC-MS/MS)。方法采用甲醇、硫酸锌沉淀蛋白,以稳定同位素为内标,正己烷提取,色谱采用甲醇和水以一定比例进行梯度洗脱,质谱采用正离子条件下多离子反应监测模式,3-epi 25(OH)D3和25(OH)D3的定量离子通道质荷比(mass to charge,m/z)均为413.3→395.3,25(OH)D2的m/z为401.4→383.4;同位素内标25(OH)D2-d3和25(OH)D3-d3的m/z分别为416.3→398.3和404.4→386.4。25(OH)D3和25(OH)D2分别以各自的标准品和同位素内标制作标准曲线;3-epi 25(OH)D3采用25(OH)D3的标准曲线和内标。评价方法的线性、精密度和准确度等,同时用本法和常规UPLC-MS/MS测定307例临床样本,考察方法的一致性,判别3-epi 25(OH)D3对常规UPLC-MS/MS测定结果的影响。结果本法可在13 min内将3-epi 25(OH)D3、25(OH)D3和25(OH)D2完全区分开,3种物质互不干扰,线性相关系数(r)>0.999,25(OH)D3总变异参数(CV)的均值(范围)为2.82%(2.45%~3.21%),批内CV为1.82%(1.76%~1.91%);25(OH)D2总CV的均值(范围)为4.34%(2.88%~7.01%),批内CV为2.62%(1.91%~3.66%)。25(OH)D2、25(OH)D3和3-epi 25(OH)D3的准确度分别104.5%~106.8%、98.9%~106.9%、108.0%~109.9%。随机测定307例临床样本,结果显示样本3-epi 25(OH)D3浓度均在3.0 ng/m L以下,本法和常规UPLC-MS/MS分析25-羟基维生素D[25(OH)D]的结果分别为15.53±8.58和(15.98±9.08)ng/m L,偏差为-0.46 ng/m L,百分偏差为-2.44%,2种方法的结果差异无统计学意义(t=0.631,P=0.53),R2=0.978。用本法测定得到的维生素D不足、缺乏和充足率分别为76.9%、14.3%、8.8%,常规法的结果分别为75.6%、15.3%、9.1%,2种方法对临床判定的一致率达94.1%,3-epi 25(OH)D3对临床常规UPLC-MS/MS基本无影响。结论成功建立了可同时区分3-epi 25(OH)D3、25(OH)D3和25(OH)D2的改良UPLC-MS/MS,该法准确、特异,为评价临床常规UPLC-MS/MS及自动化免疫分析25(OH)D的方法提供了方法学基础。