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摘要：AP3基因属于MADS-box基因家族中控制花器官发育的B类基因，与PI基因一起参与控制植物花瓣和雄蕊的形成。克隆到了辣椒控制花器官发育的PAP3基因（GenBank登录号：HM104635），该基因全长929 bp，编码226个氨基酸，具有典型的MADS结构域和K结构域；与其他6种植物同源基因比对显示，它们的氨基酸序列相似性在82%～91%之间；系统进化树分析表明，PAP3属于MADS-box基因家族中的AP3/PI亚族成员，与辣椒花器官发育相关。
关键词：辣椒；PAP3基因；花器官发育；生物信息学
中图分类号： S641.303.2 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2016）07-0052-03
AP3基因均属于MADS-box基因家族中控制花器官发育的B类基因。参与调控高等植物花器官发育的 MADS-box基因是近年来植物发育生物学研究的热点，目前已经在多种作物上克隆到B类基因[1-2]。经研究表明，B类基因参与花瓣、雄蕊的形成。在丧失功能的突变体中，萼片代替第2轮花瓣，第3轮雄蕊转变为心皮[3-4]，植物B类基因结构属于植物MADS-box基因家族，含有相同的4個区域：MADS结构域、K结构域、I结构域和C结构域。启动子表达特性的分析显示，AP3基因启动子为花器官特异表达启动子[5]。最新研究表明，AP3基因的表达形式取决于编码转录因子的分生组织特征基因LEAFY、AP1，并且配合着不寻常的花器官活动，编码了F-BOX蛋白[6-8]。AP3在拟南芥花瓣、雄蕊的整个发育过程中均有表达，但是在非花组织中不表达[9-11]。
本研究从实验室已经构建的辣椒不育系和恢复系的差减cDNA文库中获得辣椒恢复基因诱导的EST片段TA288[12]，利用RACE（rapid-amplification of cDNA ends）技术进行全长cDNA克隆，获得了辣椒花器官发育PAP3基因的全长，并利用 RT-PCR 技术、Northern blot技术检测了该基因在辣椒不同材料、不同器官上及小孢子发育的不同时期的表达量差异，以期为阐明辣椒花器官发育的分子调控机制奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
以辣椒细胞质雄性不育系121A及其相应的恢复系121C为试验材料（笔者所在实验室育种材料）。2012年春季在中国农业大学上庄实验站大棚内常规种植。在开花期，取121C花瓣已开始变白的花蕾，剥取花药后立即用液氮冷冻并在-70 ℃保存备用，用于基因全长克隆。
1.2 总RNA的提取及基因的全长克隆
总RNA的提取依照SV Total RNA Isolation System kit（美国 Promega 公司）操作说明书进行。基因全长克隆采用 RACE 技术，按照 Smart Race cDNA Amplification Kit（美国 Clontech 公司）试剂盒说明书进行。根据实验室已经获得的 EST 片段分别设计 3′端、5′端特异引物（5′-TGAGTGTGCGAATGATTGCTGGGGGTTT-3′）、（5′-ACCCCCAGCAATCATTCGCACACTCAAA-3′）进行cDNA末端快速扩增（RACE）。扩增产物采用北京鼎国生物技术有限责任公司的DNA凝胶回收试剂盒回收。插入pGEM-T Easy载体（美国Promega公司），热激法转化到E.coli DH5α感受态细胞（中国天根公司）中，在氨苄青霉素平板上进行阳性克隆筛选，送交三博远志生物技术有限公司测序。测序结果在NCBI网站上 进行Blast比对，用 DNAMAN软件进行序列分析，用MEGA 41软件构建系统进化树。
2 结果与分析
2.1 辣椒PAP3基因的克隆与序列分析
在已经构建的辣椒CMS诱导表达的cDNA文库中，筛选到 EST序列TA288，经Blast比对分析表明，该片段与植物花器官发育AP3基因序列有较高的同源性，推测其为辣椒花器官发育MADS-box基因之一，进而设计特异引物序列进行3′、5′RACE扩增，分别获得752 bp的3′端序列、625 bp的5′端序列。利用DNAMAN软件去除2端载体序列和重叠部分，将2段序列进行拼接，得到长度为929 bp的基因全长序列，命名为PAP3（GenBank登录号：HM104635）。用特异性引物在基因组DNA和cDNA上同时扩增PAP3基因，琼脂糖跑胶结果显示条带完全相同，测序后分析序列完全相同（图1）。
PAP3基因包含678 bp的开放阅读框，编码1个含226个氨基酸的蛋白质，推测的分子量为75.9 ku，推测的等电点为4.97。蛋白结构域分析表明，PAP3蛋白含有典型的MADS结构域（氨基酸序列第2～61位）和K结构域（氨基酸序列第86-176）2个保守结构域（图2、图3）。由此推测：PAP3基因应属于MADS-box基因家族Ⅱ型基因。
2.2 PAP3氨基酸序列同源性比较与系统进化树分析
由图4可以看出，氨基酸序列的5′端保守性较高，而3′端保守性较低，这是MADS-box基因的典型特征。这6个序列是从NCBI上下载，并用DNAMAN软件进行分析的，分别为番茄（NM_001247148）、矮牵牛（Q07472）、马铃薯（X67508）、曼陀罗（AEM60197）、风茄（DQ539405）、烟草（X96428）序列。
在拟南芥中与花发育相关的MADS-box基因分为5个亚族：AP1、AP3/PI、AG、AGL2和孤儿亚族。以拟南芥中的5个亚族作为对照，选取其中一些典型基因对PAP3基因进行系统进化树分析，图5结果表明，PAP3基因与拟南芥AP3
（NP_191002）基因聚为一类，属于MADS-box基因家族中的AP3/PI亚族成员，为植物花器官发育B类功能基因。3 讨论 与其他作物相比，在辣椒中大多数的MADS-box基因仍未被克隆及研究，本试验通过RACE技术克隆了辣椒花器官发育相关的1个MADS-box基因PAP3。氨基酸序列分析和蛋白结构域分析表明，PAP3基因含有典型的MADS-box区域、K-box区域，N端的保守性高于C端。并且与番茄的TAP3 （NM_001247148）、拟南芥（NP191002）具有很高的序列同源性，因此属于MADS-box基因家族。
系统树分析表明，PAP3基因属于MADS-box基因家族中的AP3/PI亞家族成员，为ABC花发育模型理论中的B功能基因，控制植物花瓣和雄蕊的发育[13-17]。与AP1亚家族相比，对AP3/PI亚家族的研究比较深入。在这个亚家族的进化过程中主要发生了2次基因重复事件。1次基因重复事件发生在现存的被子植物产生之前，产生了AP3/DEF、PI/GLO 这2个进化系；随后，AP3/DEF进化系中又发生了1次基因重复事件，发生在核心真双子叶植物基部，相似于 euAP1 重复的位置，结果产生TM6、euAP3进化系。在这个亚家族里，经历基因重复后，在拟南芥中产生了AP3、PI基因，金鱼草中产生了DEF、GLO基因[18-20]。
本研究表明，PAP3基因属于MADS-box基因家族中控制花瓣和雄蕊发育的B功能基因，今后可通过继续深入研究PAP3基因的功能，最终为阐明辣椒花器官发育的分子调控机制奠定基础。
参考文献：
[1]Tsai W C，Lee P F，Chen H I，et al. PeMADS6，a GLOBOSA/PISTILLATA-like gene in Phalaenopsis equestris involved in petaloid formation，and correlated with flower longevity and ovary development[J]. Plant
关键词：辣椒；PAP3基因；花器官发育；生物信息学
中图分类号： S641.303.2 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2016）07-0052-03
AP3基因均属于MADS-box基因家族中控制花器官发育的B类基因。参与调控高等植物花器官发育的 MADS-box基因是近年来植物发育生物学研究的热点，目前已经在多种作物上克隆到B类基因[1-2]。经研究表明，B类基因参与花瓣、雄蕊的形成。在丧失功能的突变体中，萼片代替第2轮花瓣，第3轮雄蕊转变为心皮[3-4]，植物B类基因结构属于植物MADS-box基因家族，含有相同的4個区域：MADS结构域、K结构域、I结构域和C结构域。启动子表达特性的分析显示，AP3基因启动子为花器官特异表达启动子[5]。最新研究表明，AP3基因的表达形式取决于编码转录因子的分生组织特征基因LEAFY、AP1，并且配合着不寻常的花器官活动，编码了F-BOX蛋白[6-8]。AP3在拟南芥花瓣、雄蕊的整个发育过程中均有表达，但是在非花组织中不表达[9-11]。
本研究从实验室已经构建的辣椒不育系和恢复系的差减cDNA文库中获得辣椒恢复基因诱导的EST片段TA288[12]，利用RACE（rapid-amplification of cDNA ends）技术进行全长cDNA克隆，获得了辣椒花器官发育PAP3基因的全长，并利用 RT-PCR 技术、Northern blot技术检测了该基因在辣椒不同材料、不同器官上及小孢子发育的不同时期的表达量差异，以期为阐明辣椒花器官发育的分子调控机制奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
以辣椒细胞质雄性不育系121A及其相应的恢复系121C为试验材料（笔者所在实验室育种材料）。2012年春季在中国农业大学上庄实验站大棚内常规种植。在开花期，取121C花瓣已开始变白的花蕾，剥取花药后立即用液氮冷冻并在-70 ℃保存备用，用于基因全长克隆。
1.2 总RNA的提取及基因的全长克隆
总RNA的提取依照SV Total RNA Isolation System kit（美国 Promega 公司）操作说明书进行。基因全长克隆采用 RACE 技术，按照 Smart Race cDNA Amplification Kit（美国 Clontech 公司）试剂盒说明书进行。根据实验室已经获得的 EST 片段分别设计 3′端、5′端特异引物（5′-TGAGTGTGCGAATGATTGCTGGGGGTTT-3′）、（5′-ACCCCCAGCAATCATTCGCACACTCAAA-3′）进行cDNA末端快速扩增（RACE）。扩增产物采用北京鼎国生物技术有限责任公司的DNA凝胶回收试剂盒回收。插入pGEM-T Easy载体（美国Promega公司），热激法转化到E.coli DH5α感受态细胞（中国天根公司）中，在氨苄青霉素平板上进行阳性克隆筛选，送交三博远志生物技术有限公司测序。测序结果在NCBI网站上 进行Blast比对，用 DNAMAN软件进行序列分析，用MEGA 41软件构建系统进化树。
2 结果与分析
2.1 辣椒PAP3基因的克隆与序列分析
在已经构建的辣椒CMS诱导表达的cDNA文库中，筛选到 EST序列TA288，经Blast比对分析表明，该片段与植物花器官发育AP3基因序列有较高的同源性，推测其为辣椒花器官发育MADS-box基因之一，进而设计特异引物序列进行3′、5′RACE扩增，分别获得752 bp的3′端序列、625 bp的5′端序列。利用DNAMAN软件去除2端载体序列和重叠部分，将2段序列进行拼接，得到长度为929 bp的基因全长序列，命名为PAP3（GenBank登录号：HM104635）。用特异性引物在基因组DNA和cDNA上同时扩增PAP3基因，琼脂糖跑胶结果显示条带完全相同，测序后分析序列完全相同（图1）。
PAP3基因包含678 bp的开放阅读框，编码1个含226个氨基酸的蛋白质，推测的分子量为75.9 ku，推测的等电点为4.97。蛋白结构域分析表明，PAP3蛋白含有典型的MADS结构域（氨基酸序列第2～61位）和K结构域（氨基酸序列第86-176）2个保守结构域（图2、图3）。由此推测：PAP3基因应属于MADS-box基因家族Ⅱ型基因。
2.2 PAP3氨基酸序列同源性比较与系统进化树分析
由图4可以看出，氨基酸序列的5′端保守性较高，而3′端保守性较低，这是MADS-box基因的典型特征。这6个序列是从NCBI上下载，并用DNAMAN软件进行分析的，分别为番茄（NM_001247148）、矮牵牛（Q07472）、马铃薯（X67508）、曼陀罗（AEM60197）、风茄（DQ539405）、烟草（X96428）序列。
在拟南芥中与花发育相关的MADS-box基因分为5个亚族：AP1、AP3/PI、AG、AGL2和孤儿亚族。以拟南芥中的5个亚族作为对照，选取其中一些典型基因对PAP3基因进行系统进化树分析，图5结果表明，PAP3基因与拟南芥AP3
（NP_191002）基因聚为一类，属于MADS-box基因家族中的AP3/PI亚族成员，为植物花器官发育B类功能基因。3 讨论 与其他作物相比，在辣椒中大多数的MADS-box基因仍未被克隆及研究，本试验通过RACE技术克隆了辣椒花器官发育相关的1个MADS-box基因PAP3。氨基酸序列分析和蛋白结构域分析表明，PAP3基因含有典型的MADS-box区域、K-box区域，N端的保守性高于C端。并且与番茄的TAP3 （NM_001247148）、拟南芥（NP191002）具有很高的序列同源性，因此属于MADS-box基因家族。
系统树分析表明，PAP3基因属于MADS-box基因家族中的AP3/PI亞家族成员，为ABC花发育模型理论中的B功能基因，控制植物花瓣和雄蕊的发育[13-17]。与AP1亚家族相比，对AP3/PI亚家族的研究比较深入。在这个亚家族的进化过程中主要发生了2次基因重复事件。1次基因重复事件发生在现存的被子植物产生之前，产生了AP3/DEF、PI/GLO 这2个进化系；随后，AP3/DEF进化系中又发生了1次基因重复事件，发生在核心真双子叶植物基部，相似于 euAP1 重复的位置，结果产生TM6、euAP3进化系。在这个亚家族里，经历基因重复后，在拟南芥中产生了AP3、PI基因，金鱼草中产生了DEF、GLO基因[18-20]。
本研究表明，PAP3基因属于MADS-box基因家族中控制花瓣和雄蕊发育的B功能基因，今后可通过继续深入研究PAP3基因的功能，最终为阐明辣椒花器官发育的分子调控机制奠定基础。
参考文献：
[1]Tsai W C，Lee P F，Chen H I，et al. PeMADS6，a GLOBOSA/PISTILLATA-like gene in Phalaenopsis equestris involved in petaloid formation，and correlated with flower longevity and ovary development[J]. Plant