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摘要 南方番茄病毒Southern tomato virus （STV）是近年来新发现的一种侵染番茄的病毒，通常与多种病毒复合侵染，可能与番茄的褪绿、黄化、衰退、果实变小等症状相关。该病毒最早在1984年发现，并于2005年命名。我国首先于2015年在山东寿光发现。最近，我们在山东和北京市多地的番茄样品中均检测到了该病毒，并通过检测发现国内一些主要品种番茄种子的STV携带率达40%。STV基因组为一条双链RNA，隶属Amalgaviridae科Amalgavirus属，是严格种传病毒，不能通过汁液摩擦接种和嫁接传播。鉴于STV的潜在危害以及与其他病毒高度复合侵染造成的严重损失，本文介绍了STV检测方法，并提出应开展对主栽品种的种子检测和针对性防控。
关键词 南方番茄病毒; 复合侵染; 种子传播; 防治措施; 种子检测
中图分类号： S 432.1
文献标识码： BDOI： 10.16688/j.zwbh.2018427
Abstract Southern tomato virus （STV） is a recently identified virus infecting tomato， which normally occurs together with a variety of viruses， and may cause chlorosis， yellowing， decline and small fruit. STV was discovered in 1984 and was named in 2005. In China， STV was firstly reported in Shouguang， Shandong province in 2015. We detected STV in tomato samples of Shandong and Beijing， and our work showed that the incidence of STV in seeds of main cultivars reached 40%. Being a member of Amalgavirus in Amalgaviridae， the STV genome is a doublestranded RNA. As a rigorous seedborne virus， STV cannot be transmitted by mechanical inoculation or grafting. In view of its potential damages and the severe losses induced by high degree of complex infection with other viruses， we introduced the detection method for STV， and recommended that seeds detection and targeted control measures should be carried out.
Key words Southern tomato virus; coinfection; seedborne; control measures; detection of seed
近年在我国一些番茄重要生产区（山东寿光，北京房山、昌平等地）的番茄植株上发生一种顶端叶片黄化、植株长势逐渐衰弱、后期逐渐白化直至枯死的病害（图1）。棚室内病株发生率30%～100%，特别是无土栽培和基质栽培的棚室内，发生率超过50%，严重危害番茄生产。起初认为是缺素症，但在常规土壤栽培中也高比例发生;有专家表示在营养液中添加游离状态的铁离子一定程度上减轻了病害症状，但不能痊愈。
为探讨是否有病毒参与这一病害的发生，我们利用深度测序鉴定病毒的方法，对北京房山和昌平的番茄样品分别进行了病毒病原检测，发现2份样品中均有南方番茄病毒Southern tomato virus（STV），说明STV与这一病害有相关性。为调查STV的发生，在京郊4个区县采集番茄样品32份进行反转录PCR检测，在11份样品中检测到了STV，检出率为34.4%;在山东寿光采集54份番茄样品，检测到10份样品为STV阳性，检出率为18.5%。目前研究表明STV仅通过种子垂直传播。为调查国内番茄种子携带STV情况，对销量最高的10家网店的20份番茄种子进行STV检测。催芽后混样检測发现8份种子携带STV，对8份带毒种子进行单粒检测，带毒率为20%～75%。这些数据表明STV已在我国一些番茄主栽品种上普遍发生，应引起注意。
1 STV的发现
1984年美国加利福尼亚州因皮里尔河谷的番茄出现黄化、衰退和坐果少等病毒病症状，但未分离到病原物，并且无法通过嫁接传播到健康植株，在病株体内可分离到3.5 kb的双链RNA （ds RNA）[1]。2005年，在墨西哥西南部和密西西比东北部的番茄中出现了生长点矮化、果实变小和变色等症状，成熟植株常表现出叶脉间失绿[23]，两地的病株中都分离出了3.5 kb的dsRNA。推测这3个地方的番茄被同一种新病毒所感染，命名为南方番茄病毒（STV）[4]。
2 分布情况
已在多个国家有报道STV的发生，包括北美洲的墨西哥和美国[5]，欧洲的法国[6]和西班牙[7]，亚洲的中国[8]和孟加拉国[9]。
我国首先在山东寿光的温室番茄上发现STV[8]，随后在新疆的加工番茄上也检测到[10]。我们在北京市房山区、昌平区、通州区、顺义区采集的番茄样品中检测到STV。
3 与其他病毒复合侵染导致严重危害
STV单独侵染对番茄的致病症状尚不明确，但STV与番茄的褪绿、黄化、衰退、果实变小等症状相关[4]，虽然尚未证实其直接相关性。STV通常与其他病毒混合感染。在法国，STV与烟草花叶病毒Tobacco mosaic virus （TMV）和马铃薯Y病毒Potato virus Y （PVY）复合侵染[6]。在西班牙发现，STV与人参果花叶病毒Pepino mosaic virus （PepMV），番茄斑萎病毒Tomato spotted wilt virus （TSWV）和番茄黄化曲叶病毒Tomato yellow leaf curl virus （TYLCV）共同感染[7]。孟加拉国的番茄样品中还鉴定到PVY和黄瓜花叶病毒Cucumber mosaic virus （CMV）[9]。山东寿光番茄样品中检测到STV与TYLCV、CMV、番茄褪绿病毒Tomato chlorosis virus （ToCV）[8]混合感染;在新疆番茄样品中同时检测到STV、CMV、PVY及番茄花叶病毒Tomato mosaic virus （ToMV）[10]。我们在北京房山检测到STV与TYLCV、ToCV复合侵染。 4 分類和基因组
STV基因组为一条双链RNA（doublestranded RNA， dsRNA），长约3.5 kb，编码2个重叠的开放阅读框（ORF）[5]。ORF1长1 134 nt，编码377个氨基酸（amino acid，aa），推测为外壳蛋白（coat protein，CP），分子量为 42.4 kD （p42）;ORF2长2 289 nt，编码762 个氨基酸的依赖于RNA的 RNA 聚合酶（RNAdependent RNApolymerase，RdRp），分子量为 87.4 kD （p87）[5]。基于其dsRNA基因组和基因组结构模式，STV被归类为Amalgaviridae科Amalgavirus属[5]。
目前NCBI数据库收录了13条STV基因组全序列，比对发现从中国（KT438549）、墨西哥（EF442780）、美国（EU413670）、法国（KC333078）、孟加拉国（KT634055）鉴定的STV分离株具有99%的核苷酸序列相似性。这些STV不同分离物之间高度序列保守性说明它们可能来自同一源头，即带毒的番茄种子。
5 传播方式和寄主范围
STV是严格种传病毒，不能通过汁液摩擦接种和嫁接传播[10]，尚未发现有昆虫介体传播。STV通过品种引进、品种培养和良种繁育等过程传播[11]。因此，建立快速、准确的病毒检测方法是STV病害监控和防治的关键。
目前仅在一些品种的番茄上检测到STV。在蓝莓和杜鹃花上检测到了与STV相似的dsRNA病毒[4，1215]，引起蓝莓落果，在杜鹃花上不引起明显的症状。
6 检测方法
为检测番茄种子或番茄苗是否被STV侵染，参考使用如下方法[5]：将1粒或4～5粒番茄种子、或取番茄苗一片叶片在液氮中充分研磨。利用TRIzol试剂或其他方法提取总RNA后，进行反转录反应：样品总RNA 3.5 μL、5×MMLV Buffer 4.0 μL、随机引物（10 μmol/L）1.0 μL、dNTPs （10 mmol/L） 1.0 μL、RNA酶抑制剂0.5 μL、MMLV酶0.5 μL，加DEPC水至20 μL，37℃反应1 h，于-20℃保存。
利用STV检测引物STVF （5′CGTTATCTTAGGCGTCAGCT3′），STVR （5′GGAGTTTGATTGCATCAGCG3′）[5]进行PCR，反应体系为：反转录产物cDNA 2.0 μL、10×Buffer 2.5 μL、dNTPs （10 mmol/L）0.5 μL、正向和反向引物（10 μmol/L）各0.5 μL、Taq DNA聚合酶0.25 μL，加ddH2O至25 μL。PCR参数为94℃预变性3 min，94℃变性30 s，52℃复性45 s，72℃延伸40 s，35个循环，最后72℃延伸10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶进行电泳，目标条带为400 bp。如果需要测序验证，可利用DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒回收PCR产物，连接到克隆载体pMD18T，对阳性克隆测序，所得序列与GenBank中序列进行比对。
7 开展检测特别是番茄种子检测，最大程度降低STV扩散危害
鉴于STV的潜在危害以及与其他病毒高度复合侵染造成的严重损失，应进行种子检测和针对性防控。由于种子是STV目前唯一已知的传播途径，因此应加大对种子的检测力度，对种子进行严格检疫，使用经过认证的、经过病毒检测的种子，不出售、不引进、不购买携带STV的种子，并对有症状的植株进行早期诊断、及时清理，从根源杜绝带毒种子在农业生产上的使用。对制种田的番茄植株进行抽检是必要的措施。
参考文献
[1] LAEMMLEN F F， VAN MAREN A F， ENDO R M， et al. A tomato decline of unknown etiology in Imperial Valley， CA[J]. Phytopathology， 1985， 75： 1287.
[2] TURINA M， RICKER M D， LENZI R， et al. A severe disease of tomato in the Culiacan area （Sinaloa， Mexico） is caused by a new picornalike viral species [J]. Plant Disease， 2007， 91（8）： 932941.
[3] VERBEEK M， DULLEMANS A M， VAN DEN HEUVEL J F J M， et al. Identification and characterization of Tomato torrado virus， a new plant picornalike virus from tomato [J]. Archives of Virology， 2007， 152（5）： 881890.
[4] SABANADZOVIC S， GHANEMSABANADZOVIC N A， VALVERDE R A. A novel monopartite dsRNA virus from rhododendron[J]. Archives of Virology， 2010， 155：18591863.
[5] SABANADZOVIC S， VALVERDE R A， BROWN J K， et al. Southern tomato virus： The link between the families Totiviridae and Partitiviridae [J]. Virus Research， 2009， 140：130137. [6] CANDRESSE T， MARAIS A， FAURE C. First report of Southern tomato virus on tomatoes in southwest France [J]. Plant Disease， 2013， 97： 1124.
[7] VERBEEK M， DULLEMANS A M， ESPINO A， et al. First report of Southern tomato virus in tomato in the Canary Islands， Spain [J].Journal of Plant Pathology，2015，97： 392.
[8] PADMANABHAN C， YI Zheng， LI Rugang， et al. Complete genome sequence of Southern tomato virus identified in China using nextgeneration sequencing [J/OL]. Genome Announcements， 2015， 3（5）： e0122615.
[9] PADMANABHAN C， YI Zheng， LI Rugang， et al. Complete genome sequence of Southern tomato virus naturally infecting tomatoes in Bangladesh [J/OL].Genome Announcements，2015，3（6）：e0152215.
[10]张强，崔百明，鄭银英，等.新疆加工番茄上南方番茄病毒外壳蛋白基因的克隆与原核表达[J].西北农林科技大学学报（自然科学版），2015，43（4）：118122.
[11]苏海娣，梁学超，崔百明，等.新疆加工番茄上一种类似南方番茄病毒的分子检测[J].石河子大学学报（自然科学版），2013，31（3）：271275.
[12]HALGREN A， TZANETAKIS I E， MARTIN R R.Identification， characterization， and detection of a virus associated with decline symptoms in black raspberry[J]. Phytopathology， 2007， 97（1）： 4450.
[13]MARTIN R R， ZHOU J， TZANETAKIS I E.Blueberry latent virus： an amalgam of the Partitiviridae and Totiviridae[J]. Virus Research， 2011， 155（1）： 175180.
[14]MARTIN R R， TZANETAKIS I E， SWEENEY M， et a1. A virus associated with blueberry fruit drop disease[J]. Acta Horticulture， 2006， 715： 497501.
[15]ISOGAI M， NAKAMURA T， ISHII K， et al. Histochemical detection of Blueberry latent virus in highbush blueberry plant [J]. Journal of General Plant Pathology， 2011， 77（5）： 304306.
（责任编辑：杨明丽）
关键词 南方番茄病毒; 复合侵染; 种子传播; 防治措施; 种子检测
中图分类号： S 432.1
文献标识码： BDOI： 10.16688/j.zwbh.2018427
Abstract Southern tomato virus （STV） is a recently identified virus infecting tomato， which normally occurs together with a variety of viruses， and may cause chlorosis， yellowing， decline and small fruit. STV was discovered in 1984 and was named in 2005. In China， STV was firstly reported in Shouguang， Shandong province in 2015. We detected STV in tomato samples of Shandong and Beijing， and our work showed that the incidence of STV in seeds of main cultivars reached 40%. Being a member of Amalgavirus in Amalgaviridae， the STV genome is a doublestranded RNA. As a rigorous seedborne virus， STV cannot be transmitted by mechanical inoculation or grafting. In view of its potential damages and the severe losses induced by high degree of complex infection with other viruses， we introduced the detection method for STV， and recommended that seeds detection and targeted control measures should be carried out.
Key words Southern tomato virus; coinfection; seedborne; control measures; detection of seed
近年在我国一些番茄重要生产区（山东寿光，北京房山、昌平等地）的番茄植株上发生一种顶端叶片黄化、植株长势逐渐衰弱、后期逐渐白化直至枯死的病害（图1）。棚室内病株发生率30%～100%，特别是无土栽培和基质栽培的棚室内，发生率超过50%，严重危害番茄生产。起初认为是缺素症，但在常规土壤栽培中也高比例发生;有专家表示在营养液中添加游离状态的铁离子一定程度上减轻了病害症状，但不能痊愈。
为探讨是否有病毒参与这一病害的发生，我们利用深度测序鉴定病毒的方法，对北京房山和昌平的番茄样品分别进行了病毒病原检测，发现2份样品中均有南方番茄病毒Southern tomato virus（STV），说明STV与这一病害有相关性。为调查STV的发生，在京郊4个区县采集番茄样品32份进行反转录PCR检测，在11份样品中检测到了STV，检出率为34.4%;在山东寿光采集54份番茄样品，检测到10份样品为STV阳性，检出率为18.5%。目前研究表明STV仅通过种子垂直传播。为调查国内番茄种子携带STV情况，对销量最高的10家网店的20份番茄种子进行STV检测。催芽后混样检測发现8份种子携带STV，对8份带毒种子进行单粒检测，带毒率为20%～75%。这些数据表明STV已在我国一些番茄主栽品种上普遍发生，应引起注意。
1 STV的发现
1984年美国加利福尼亚州因皮里尔河谷的番茄出现黄化、衰退和坐果少等病毒病症状，但未分离到病原物，并且无法通过嫁接传播到健康植株，在病株体内可分离到3.5 kb的双链RNA （ds RNA）[1]。2005年，在墨西哥西南部和密西西比东北部的番茄中出现了生长点矮化、果实变小和变色等症状，成熟植株常表现出叶脉间失绿[23]，两地的病株中都分离出了3.5 kb的dsRNA。推测这3个地方的番茄被同一种新病毒所感染，命名为南方番茄病毒（STV）[4]。
2 分布情况
已在多个国家有报道STV的发生，包括北美洲的墨西哥和美国[5]，欧洲的法国[6]和西班牙[7]，亚洲的中国[8]和孟加拉国[9]。
我国首先在山东寿光的温室番茄上发现STV[8]，随后在新疆的加工番茄上也检测到[10]。我们在北京市房山区、昌平区、通州区、顺义区采集的番茄样品中检测到STV。
3 与其他病毒复合侵染导致严重危害
STV单独侵染对番茄的致病症状尚不明确，但STV与番茄的褪绿、黄化、衰退、果实变小等症状相关[4]，虽然尚未证实其直接相关性。STV通常与其他病毒混合感染。在法国，STV与烟草花叶病毒Tobacco mosaic virus （TMV）和马铃薯Y病毒Potato virus Y （PVY）复合侵染[6]。在西班牙发现，STV与人参果花叶病毒Pepino mosaic virus （PepMV），番茄斑萎病毒Tomato spotted wilt virus （TSWV）和番茄黄化曲叶病毒Tomato yellow leaf curl virus （TYLCV）共同感染[7]。孟加拉国的番茄样品中还鉴定到PVY和黄瓜花叶病毒Cucumber mosaic virus （CMV）[9]。山东寿光番茄样品中检测到STV与TYLCV、CMV、番茄褪绿病毒Tomato chlorosis virus （ToCV）[8]混合感染;在新疆番茄样品中同时检测到STV、CMV、PVY及番茄花叶病毒Tomato mosaic virus （ToMV）[10]。我们在北京房山检测到STV与TYLCV、ToCV复合侵染。 4 分類和基因组
STV基因组为一条双链RNA（doublestranded RNA， dsRNA），长约3.5 kb，编码2个重叠的开放阅读框（ORF）[5]。ORF1长1 134 nt，编码377个氨基酸（amino acid，aa），推测为外壳蛋白（coat protein，CP），分子量为 42.4 kD （p42）;ORF2长2 289 nt，编码762 个氨基酸的依赖于RNA的 RNA 聚合酶（RNAdependent RNApolymerase，RdRp），分子量为 87.4 kD （p87）[5]。基于其dsRNA基因组和基因组结构模式，STV被归类为Amalgaviridae科Amalgavirus属[5]。
目前NCBI数据库收录了13条STV基因组全序列，比对发现从中国（KT438549）、墨西哥（EF442780）、美国（EU413670）、法国（KC333078）、孟加拉国（KT634055）鉴定的STV分离株具有99%的核苷酸序列相似性。这些STV不同分离物之间高度序列保守性说明它们可能来自同一源头，即带毒的番茄种子。
5 传播方式和寄主范围
STV是严格种传病毒，不能通过汁液摩擦接种和嫁接传播[10]，尚未发现有昆虫介体传播。STV通过品种引进、品种培养和良种繁育等过程传播[11]。因此，建立快速、准确的病毒检测方法是STV病害监控和防治的关键。
目前仅在一些品种的番茄上检测到STV。在蓝莓和杜鹃花上检测到了与STV相似的dsRNA病毒[4，1215]，引起蓝莓落果，在杜鹃花上不引起明显的症状。
6 检测方法
为检测番茄种子或番茄苗是否被STV侵染，参考使用如下方法[5]：将1粒或4～5粒番茄种子、或取番茄苗一片叶片在液氮中充分研磨。利用TRIzol试剂或其他方法提取总RNA后，进行反转录反应：样品总RNA 3.5 μL、5×MMLV Buffer 4.0 μL、随机引物（10 μmol/L）1.0 μL、dNTPs （10 mmol/L） 1.0 μL、RNA酶抑制剂0.5 μL、MMLV酶0.5 μL，加DEPC水至20 μL，37℃反应1 h，于-20℃保存。
利用STV检测引物STVF （5′CGTTATCTTAGGCGTCAGCT3′），STVR （5′GGAGTTTGATTGCATCAGCG3′）[5]进行PCR，反应体系为：反转录产物cDNA 2.0 μL、10×Buffer 2.5 μL、dNTPs （10 mmol/L）0.5 μL、正向和反向引物（10 μmol/L）各0.5 μL、Taq DNA聚合酶0.25 μL，加ddH2O至25 μL。PCR参数为94℃预变性3 min，94℃变性30 s，52℃复性45 s，72℃延伸40 s，35个循环，最后72℃延伸10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶进行电泳，目标条带为400 bp。如果需要测序验证，可利用DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒回收PCR产物，连接到克隆载体pMD18T，对阳性克隆测序，所得序列与GenBank中序列进行比对。
7 开展检测特别是番茄种子检测，最大程度降低STV扩散危害
鉴于STV的潜在危害以及与其他病毒高度复合侵染造成的严重损失，应进行种子检测和针对性防控。由于种子是STV目前唯一已知的传播途径，因此应加大对种子的检测力度，对种子进行严格检疫，使用经过认证的、经过病毒检测的种子，不出售、不引进、不购买携带STV的种子，并对有症状的植株进行早期诊断、及时清理，从根源杜绝带毒种子在农业生产上的使用。对制种田的番茄植株进行抽检是必要的措施。
参考文献
[1] LAEMMLEN F F， VAN MAREN A F， ENDO R M， et al. A tomato decline of unknown etiology in Imperial Valley， CA[J]. Phytopathology， 1985， 75： 1287.
[2] TURINA M， RICKER M D， LENZI R， et al. A severe disease of tomato in the Culiacan area （Sinaloa， Mexico） is caused by a new picornalike viral species [J]. Plant Disease， 2007， 91（8）： 932941.
[3] VERBEEK M， DULLEMANS A M， VAN DEN HEUVEL J F J M， et al. Identification and characterization of Tomato torrado virus， a new plant picornalike virus from tomato [J]. Archives of Virology， 2007， 152（5）： 881890.
[4] SABANADZOVIC S， GHANEMSABANADZOVIC N A， VALVERDE R A. A novel monopartite dsRNA virus from rhododendron[J]. Archives of Virology， 2010， 155：18591863.
[5] SABANADZOVIC S， VALVERDE R A， BROWN J K， et al. Southern tomato virus： The link between the families Totiviridae and Partitiviridae [J]. Virus Research， 2009， 140：130137. [6] CANDRESSE T， MARAIS A， FAURE C. First report of Southern tomato virus on tomatoes in southwest France [J]. Plant Disease， 2013， 97： 1124.
[7] VERBEEK M， DULLEMANS A M， ESPINO A， et al. First report of Southern tomato virus in tomato in the Canary Islands， Spain [J].Journal of Plant Pathology，2015，97： 392.
[8] PADMANABHAN C， YI Zheng， LI Rugang， et al. Complete genome sequence of Southern tomato virus identified in China using nextgeneration sequencing [J/OL]. Genome Announcements， 2015， 3（5）： e0122615.
[9] PADMANABHAN C， YI Zheng， LI Rugang， et al. Complete genome sequence of Southern tomato virus naturally infecting tomatoes in Bangladesh [J/OL].Genome Announcements，2015，3（6）：e0152215.
[10]张强，崔百明，鄭银英，等.新疆加工番茄上南方番茄病毒外壳蛋白基因的克隆与原核表达[J].西北农林科技大学学报（自然科学版），2015，43（4）：118122.
[11]苏海娣，梁学超，崔百明，等.新疆加工番茄上一种类似南方番茄病毒的分子检测[J].石河子大学学报（自然科学版），2013，31（3）：271275.
[12]HALGREN A， TZANETAKIS I E， MARTIN R R.Identification， characterization， and detection of a virus associated with decline symptoms in black raspberry[J]. Phytopathology， 2007， 97（1）： 4450.
[13]MARTIN R R， ZHOU J， TZANETAKIS I E.Blueberry latent virus： an amalgam of the Partitiviridae and Totiviridae[J]. Virus Research， 2011， 155（1）： 175180.
[14]MARTIN R R， TZANETAKIS I E， SWEENEY M， et a1. A virus associated with blueberry fruit drop disease[J]. Acta Horticulture， 2006， 715： 497501.
[15]ISOGAI M， NAKAMURA T， ISHII K， et al. Histochemical detection of Blueberry latent virus in highbush blueberry plant [J]. Journal of General Plant Pathology， 2011， 77（5）： 304306.
（责任编辑：杨明丽）