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根据H3和H4亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)HA基因的保守序列,分别设计合成特异性引物和用不同荧光基团标记的Taq Man探针。通过优化反应条件建立了H3和H4亚型AIV双重实时荧光定量RT-PCR检测方法。结果显示该法特异性好,敏感性达1 000拷贝/μL;组内重复与组间重复性的平均变异系数均小于3%;应用该法对96份临床样品检测,结果与病毒分离鉴定结果一致。建立的H3和H4亚型AIV双重实时荧光定量RT-PCR具有快速、特异、敏感和重复性好等优点,可用于H3和H4亚型AIV的快速诊断和监测。