复制型慢病毒VSV-G qPCR检测方法的验证及初步应用

来源 :中华微生物学和免疫学杂志 | 被引量 : 0次 | 上传用户:phpzen
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目的

建立复制型慢病毒(replication competent lentivirus, RCL) VSV-G qPCR检测方法,并进行方法学性能验证及初步应用。

方法

以慢病毒载体包膜VSV-G基因为目标序列,建立荧光定量PCR检测方法,并对方法的专属性、线性、扩增效率、精密度、准确度、线性范围、检测限、定量限及耐用性进行验证。利用所建立的方法进行CAR-T细胞、慢病毒载体生产终末细胞及慢病毒载体收获液样品的初步应用性研究。

结果

建立的VSV-G荧光定量PCR法,专属性较好,对293T细胞、PBMC细胞及C8166细胞均无特异性扩增,线性范围为1×102拷贝/test~1×109拷贝/test,R2能够达到0.998以上,扩增效率在93%~98%之间,精密度RSD<12%,准确度回收率为85%~106%,最低检出限和最低定量限分别为5拷贝/test和40拷贝/test。另外,该方法的耐用性较好。各项验证结果均表明该方法能够满足检测的要求。利用该方法对54批样品(包括CAR-T细胞、慢病毒载体及载体生产终末细胞)进行RCL C8166细胞培养法的终点检测,结果显示54批样品均为阴性。

结论

成功建立了VSV-G实时荧光定量PCR法,各项验证参数均可满足检测要求,该方法的应用将进一步提高慢病毒载体相关产品的安全性。

其他文献
目的观察叶酸(FA)补充量对不同叶酸利用能力孕妇血清叶酸(FA)、同型半胱氨酸(Hcy)水平及妊娠结局的影响。方法回顾性分析2018年1月至2020年1月张家口市妇幼保健院定期孕检并分娩的孕妇病历资料600例,将入选孕妇依据FA利用能力分为低、中、高风险组,并根据组内FA补充量分为低、高剂量两个亚组。采用直接化学发光法测定各亚组不同孕期血清FA水平,采用循环酶法测定血清Hcy水平,并比较妊娠结局。结果低风险组中低剂量组孕中、晚期血清FA、Hcy水平均低于孕早期(P<0.05);高剂量组各孕期血清FA