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单链环状DNA在纳米技术、分子生物学和医药学等领域具有广泛的应用前景，但难以大量制备一直是制约其研究和应用的难题之一。本文针对一种高效大量制备单链环状DNA的方法-逐步添加法，系统地探究了逐步添加法中各主要条件对制备单链环状DNA的影响，确定了逐步添加法中的主要关键条件为：T4 DNA连接酶Buffer浓度、单链DNA浓度、添加间隔时间、温度和Splint GC含量。以72 nt的核酸链为例，使用逐步添加法将单链环状DNA的制备得率提高至99%，产量与常用的一步法相比提高至4.9倍。本研究为高效、大量制备