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【摘 要】目的：观察输注未成熟树突状细胞（iMDCs）干预重症肌无力小鼠模型（EAMG）的发病及Syk蛋白水平变化。方法：建立小鼠重症肌无力发病模型，采用iMDCs干预实验。健康雄性小鼠50只，随机分为模型组（A）20只、干预组（B）20只和对照组（C）10只。实验从初次免疫起至第90天终止，实验结束后行EAMG临床评估并进行脾脏和淋巴结Syk蛋白表达水平比较。结果：临床评估：A组发病率高于B组；实验终止时两组临床评分分别为1.69±1.12 ；0.35±0.67（P<0.01）；C组小鼠无发病。A组小鼠的脾脏和淋巴结Syk蛋白表达水平较C组小鼠升高（P<0.01），B组较A组相比有所下降（P<0.05），但高于C组（P<0.05）。结论：输注iMDCs能够减轻重症肌无力小鼠临床症状及Syk蛋白表达，提示iMDCs干预能够调节EAMG免疫紊乱。
【关键词】实验性自身免疫性重症肌无力模型；未成熟树突状细胞；Syk蛋白
【中图分类号】R746.1 【文献标识码】A 【文章编号】1004—7484（2013）09—0036—01
重症肌无力（myasthenia gravis，MG）是神经肌肉接头（neuromuscular junction，NMJ）传递过程出现障碍的自身免疫性疾病。至今，医学界对它的发病机制尚未完全阐明。目前研究认为MG是由乙酰胆碱受体抗体（AChRAb）破坏突触后膜运动终板上的乙酰胆碱受体（AChR），导致AChR 大量丢失、出现肌无力症状的自身免疫性疾病。由抗体介导的体液免疫和T 细胞介导的细胞免疫异常被认为是其主要的发病机制之一[1]。研究表明，未成熟骨髓来源的树突状细胞（immature bone marrow dendritic cells， iMDCs）具有调节免疫的功能，能够诱导免疫抑制[2]。本实验通过静脉注射iMDCs干预EAMG小鼠模型，观察模型组与干预组的临床评分及免疫组织中Syk蛋白表达水平的变化，初步评价iMDCs的疗效。
1 资料与方法
1.1 一般资料
健康雄性Lewis小鼠50只，体重150-160 g。室温20±2℃条件进行下饲养，饲养过程中水、食任意摄取。随机分为3组：模型组（A） 20只、干预组（B） 20只和对照组（C）10只，各组生长环境、周龄、生长状况等无统计学差别（P>0.05）。
1.2实验方法
1.2.1建立实验性自身免疫性重症肌无力（experimental autoimmune myasthenia graves，EAMG）实验动物模型[3]。纯化后的Torpedo乙酰胆碱受体（AchR）与CFA乳化混合（20?g AchR，100?l CFA，100?l PBS ）。模型组（A）和干预组（B）小鼠进行各足垫皮下注射50?l免疫，每只在实验第0d，30d，60d共进行3次，建立EAMG动物模型。对照组小鼠在实验第0d，30d，60d共进行3次等量PBS足垫皮下注射。
1.2.2 iMDCs培养与注射 参照文献[4，5]的方法培养iMDCs。根据预实验结果，第6天收集iMDCs，应用荧光标记抗体（CD11c，CD40，CD86， MHC-Ⅱ）及同型对照抗体标记iMDCs表型，并用流式细胞仪及CellQuest软件对其进行检测和分析。实验前用PBS洗涤3次，以PBS调整浓度为5×105 个/ml。干预组（B）于实验第3d，33d，63d自小鼠尾静脉输注iMDCs 1ml，对照组（C） 于实验第3d，33d，63d自小鼠尾靜脉输注等量PBS。
1.3 评估方法
1.3.1 临床评估
实验结束后第90d进行EAMG临床评估，按Lennon临床患病标准评分[6]：0分，没有任何肌无力现象。l级：撕咬无力，四肢力量较差，在光滑地面上前肢打滑，活动减少且易疲劳。2级：明显无力，休息时身体呈隆起姿势，头尾下垂，大腿外展，前肢趾弯曲，动作笨拙，行走不稳。3级：严重无力表现，无撕咬动作，肌肉震颤，呼吸困难，濒死或死亡。并通过注射新斯的明50?l （0.015mg/ml）获得短暂改善验证动物重症肌无力。
1.3.2 Syk蛋白检测
非受体型酪氨酸激酶（spleen tyrosine kinase，Syk）蛋白表达水平检测[3，7，8]： 在实验第90天后以断颈法处死小鼠，夹取小鼠腹股沟、腋下淋巴结及脾脏，采用Western blot法进行Syk蛋白表达水平检测。
1.4 统计学处理
所有数据均采用SPSS18.0统计软件进行分析，计量资料都以均数±标准差（ ）表示，组间比较采用方差分析，多样本间每两个样本的比较用q检验。P<0.05表明差异具有统计学意义。
2 结果
通过临床评估A组发病率高于B组；实验终止时两组临床评分分别为1.69±1.12；0.35±0.67（P<0.01）；C组小鼠无发病。A组小鼠的脾脏和淋巴结Syk蛋白表达水平较C组小鼠升高（P<0.01），B组较A组相比Syk蛋白表达水平下降（P<0.05），但高于C组（P<0.05）。
3 讨论
MG是一种主要由AchR抗体介导的体液免疫和T 细胞依赖的细胞免疫所导致的一种自身免疫性疾病。T细胞是机体免疫的核心细胞，CD4+细胞（T辅助/诱导细胞，Th）具有辅助T淋巴细胞转变为效应细胞和B淋巴细胞生成抗体等作用，起到诱导和辅助细胞免疫及体液免疫的作用。Th细胞激活后可以分泌细胞因子，Th1主要分泌IL-2，IFN-γ，TNF-α等，激活巨噬细胞及细胞毒性T细胞的功能。Th2主要分泌IL-4，IL-5，IL-6和IL-10，下调巨噬细胞及细胞毒性T细胞的功能。而CD8+细胞（T抑制/细胞毒细胞，Ts）具有抑制T淋巴细胞活性和抑制B淋巴细胞产生抗体及产生细胞毒等作用，起到抑制细胞及体液免疫的作用。Th细胞与Ts细胞构成一个错综复杂的免疫调节系统，它们相互诱导和相互制约形成T细胞网络，对于免疫应答的调控和自身免疫稳态均有重要意义，一旦失调将导致机体免疫紊乱及一系列病理变化[9]。 EAMG是Thl、Th2细胞共同参与所致疾病[9]。EAMG模型在临床表现、电生理、超微结构形态学、组织化学、免疫学、病理学、生物效应及药效等方面与MG患者相似，被认为是研究MG的重要动物模型[10]。DCs是一类重要的抗原提呈细胞，其中iMDCs可诱导外周免疫耐受[3，11]。由于iMDCs低表达各种促炎症细胞因子和协同刺激分子（CD40、CD86）使得Th0细胞向Thl、Th2转化时缺乏适宜的第二信号和转化信号，继而导致各种EAMG致病性的Thl、Th2细胞因子产生减少[3]，从而使MG临床症状减轻。Syk是一种B细胞激活信号转导中最重要的激酶，在T细胞和B细胞的成熟和活化过程中起关键作用。
本实验通过iMDCs干预EAMG的初步研究发现iMDCs干预可以减轻EAMG小鼠临床症状及淋巴组织中Syk蛋白表达水平，提示iMDCs通过免疫调节机制减轻MG小鼠免疫紊乱，减轻病情严重程度。本实验是一个初步探索，进一步的研究应着重于研究iMDCs如何调节CD4+/CD8+细胞比例及调节性T细胞比例、相关细胞因子、突触后AChR数量变化等。
参考文献：
[1] Meriqqioli MN， Sanders DB. Autoimmune myasthenia gravis： emerging clinical and biological heterogeneity[J]. Lancet Neurol， 2009， 8（5）：475?490.
[2] van Duivenvoorde LM， van Mierlo GJ， Boonman ZF， et al. Dendritic cells： vehicles for tolerance induction an prevention of autoimmune diseases[J]. Immunobiology， 2006，211（6-8）：627-632.
[3] 胡鈺，杨欢，肖波，等.树突状细胞负载Tα146-162预防实验性自身免疫性重症肌无力的实验研究[J].中华神经科杂志，2006，39（4）：224-228.
[4] Inaba K，Inaba M，Romani N，et a1.Generation of large numbers of dendritic cels from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor[J].J Exp Med，1992，176（6）：1693-1702.
[5] Wakkach A， Fournier N， Brun V， et al. Characterization of dendritic cells that induce tolerance and T regulatory l cell differentiation in vivo[J].Immunity， 2003 18（5）：605-617.
[6] Lennon VA， Lindstrom JM， Seybold ME. Experimental autoimmune myasthenia： a model of myasthenia gravis in rats and guinea pigs[J].J Exp Med，1975 ，141（6）：1365-1375.
[7]单保恩，董青，李宏芬，等.非受体型酪氨酸激酶-Syk蛋白的提取与纯化[J].细胞与分子免疫学杂志，2004，20（2）：230-233.
[8] Stewart ZA， Pietenpol JA. Syk： a new player in the field of breast cancer[J].Breast Cancer Res， 2001；3（1）：5-7.
[9] Milani M， Ostlie N， Wang W， et al. T cells and cytokines in the pathogenesis of acquired myasthenia gravis[J].Ann N Y Acad Sci， 2003 Sep；998：284-307.
[10] 包忠蕾，闫晓波.重症肌无力动物模型的建立[J].中国神经免疫学和神经病学杂志，2010，17（1）：69-71.
[11]王国栋，李萍，陈靠山，等.多糖激活树突状细胞的免疫调节作用[J].细胞与分子免疫学杂志，2013，29，（2）：204-206.
作者简介：
大连医科大学附属第一医院神经内科，卢苗为硕士研究生。
【关键词】实验性自身免疫性重症肌无力模型；未成熟树突状细胞；Syk蛋白
【中图分类号】R746.1 【文献标识码】A 【文章编号】1004—7484（2013）09—0036—01
重症肌无力（myasthenia gravis，MG）是神经肌肉接头（neuromuscular junction，NMJ）传递过程出现障碍的自身免疫性疾病。至今，医学界对它的发病机制尚未完全阐明。目前研究认为MG是由乙酰胆碱受体抗体（AChRAb）破坏突触后膜运动终板上的乙酰胆碱受体（AChR），导致AChR 大量丢失、出现肌无力症状的自身免疫性疾病。由抗体介导的体液免疫和T 细胞介导的细胞免疫异常被认为是其主要的发病机制之一[1]。研究表明，未成熟骨髓来源的树突状细胞（immature bone marrow dendritic cells， iMDCs）具有调节免疫的功能，能够诱导免疫抑制[2]。本实验通过静脉注射iMDCs干预EAMG小鼠模型，观察模型组与干预组的临床评分及免疫组织中Syk蛋白表达水平的变化，初步评价iMDCs的疗效。
1 资料与方法
1.1 一般资料
健康雄性Lewis小鼠50只，体重150-160 g。室温20±2℃条件进行下饲养，饲养过程中水、食任意摄取。随机分为3组：模型组（A） 20只、干预组（B） 20只和对照组（C）10只，各组生长环境、周龄、生长状况等无统计学差别（P>0.05）。
1.2实验方法
1.2.1建立实验性自身免疫性重症肌无力（experimental autoimmune myasthenia graves，EAMG）实验动物模型[3]。纯化后的Torpedo乙酰胆碱受体（AchR）与CFA乳化混合（20?g AchR，100?l CFA，100?l PBS ）。模型组（A）和干预组（B）小鼠进行各足垫皮下注射50?l免疫，每只在实验第0d，30d，60d共进行3次，建立EAMG动物模型。对照组小鼠在实验第0d，30d，60d共进行3次等量PBS足垫皮下注射。
1.2.2 iMDCs培养与注射 参照文献[4，5]的方法培养iMDCs。根据预实验结果，第6天收集iMDCs，应用荧光标记抗体（CD11c，CD40，CD86， MHC-Ⅱ）及同型对照抗体标记iMDCs表型，并用流式细胞仪及CellQuest软件对其进行检测和分析。实验前用PBS洗涤3次，以PBS调整浓度为5×105 个/ml。干预组（B）于实验第3d，33d，63d自小鼠尾静脉输注iMDCs 1ml，对照组（C） 于实验第3d，33d，63d自小鼠尾靜脉输注等量PBS。
1.3 评估方法
1.3.1 临床评估
实验结束后第90d进行EAMG临床评估，按Lennon临床患病标准评分[6]：0分，没有任何肌无力现象。l级：撕咬无力，四肢力量较差，在光滑地面上前肢打滑，活动减少且易疲劳。2级：明显无力，休息时身体呈隆起姿势，头尾下垂，大腿外展，前肢趾弯曲，动作笨拙，行走不稳。3级：严重无力表现，无撕咬动作，肌肉震颤，呼吸困难，濒死或死亡。并通过注射新斯的明50?l （0.015mg/ml）获得短暂改善验证动物重症肌无力。
1.3.2 Syk蛋白检测
非受体型酪氨酸激酶（spleen tyrosine kinase，Syk）蛋白表达水平检测[3，7，8]： 在实验第90天后以断颈法处死小鼠，夹取小鼠腹股沟、腋下淋巴结及脾脏，采用Western blot法进行Syk蛋白表达水平检测。
1.4 统计学处理
所有数据均采用SPSS18.0统计软件进行分析，计量资料都以均数±标准差（ ）表示，组间比较采用方差分析，多样本间每两个样本的比较用q检验。P<0.05表明差异具有统计学意义。
2 结果
通过临床评估A组发病率高于B组；实验终止时两组临床评分分别为1.69±1.12；0.35±0.67（P<0.01）；C组小鼠无发病。A组小鼠的脾脏和淋巴结Syk蛋白表达水平较C组小鼠升高（P<0.01），B组较A组相比Syk蛋白表达水平下降（P<0.05），但高于C组（P<0.05）。
3 讨论
MG是一种主要由AchR抗体介导的体液免疫和T 细胞依赖的细胞免疫所导致的一种自身免疫性疾病。T细胞是机体免疫的核心细胞，CD4+细胞（T辅助/诱导细胞，Th）具有辅助T淋巴细胞转变为效应细胞和B淋巴细胞生成抗体等作用，起到诱导和辅助细胞免疫及体液免疫的作用。Th细胞激活后可以分泌细胞因子，Th1主要分泌IL-2，IFN-γ，TNF-α等，激活巨噬细胞及细胞毒性T细胞的功能。Th2主要分泌IL-4，IL-5，IL-6和IL-10，下调巨噬细胞及细胞毒性T细胞的功能。而CD8+细胞（T抑制/细胞毒细胞，Ts）具有抑制T淋巴细胞活性和抑制B淋巴细胞产生抗体及产生细胞毒等作用，起到抑制细胞及体液免疫的作用。Th细胞与Ts细胞构成一个错综复杂的免疫调节系统，它们相互诱导和相互制约形成T细胞网络，对于免疫应答的调控和自身免疫稳态均有重要意义，一旦失调将导致机体免疫紊乱及一系列病理变化[9]。 EAMG是Thl、Th2细胞共同参与所致疾病[9]。EAMG模型在临床表现、电生理、超微结构形态学、组织化学、免疫学、病理学、生物效应及药效等方面与MG患者相似，被认为是研究MG的重要动物模型[10]。DCs是一类重要的抗原提呈细胞，其中iMDCs可诱导外周免疫耐受[3，11]。由于iMDCs低表达各种促炎症细胞因子和协同刺激分子（CD40、CD86）使得Th0细胞向Thl、Th2转化时缺乏适宜的第二信号和转化信号，继而导致各种EAMG致病性的Thl、Th2细胞因子产生减少[3]，从而使MG临床症状减轻。Syk是一种B细胞激活信号转导中最重要的激酶，在T细胞和B细胞的成熟和活化过程中起关键作用。
本实验通过iMDCs干预EAMG的初步研究发现iMDCs干预可以减轻EAMG小鼠临床症状及淋巴组织中Syk蛋白表达水平，提示iMDCs通过免疫调节机制减轻MG小鼠免疫紊乱，减轻病情严重程度。本实验是一个初步探索，进一步的研究应着重于研究iMDCs如何调节CD4+/CD8+细胞比例及调节性T细胞比例、相关细胞因子、突触后AChR数量变化等。
参考文献：
[1] Meriqqioli MN， Sanders DB. Autoimmune myasthenia gravis： emerging clinical and biological heterogeneity[J]. Lancet Neurol， 2009， 8（5）：475?490.
[2] van Duivenvoorde LM， van Mierlo GJ， Boonman ZF， et al. Dendritic cells： vehicles for tolerance induction an prevention of autoimmune diseases[J]. Immunobiology， 2006，211（6-8）：627-632.
[3] 胡鈺，杨欢，肖波，等.树突状细胞负载Tα146-162预防实验性自身免疫性重症肌无力的实验研究[J].中华神经科杂志，2006，39（4）：224-228.
[4] Inaba K，Inaba M，Romani N，et a1.Generation of large numbers of dendritic cels from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor[J].J Exp Med，1992，176（6）：1693-1702.
[5] Wakkach A， Fournier N， Brun V， et al. Characterization of dendritic cells that induce tolerance and T regulatory l cell differentiation in vivo[J].Immunity， 2003 18（5）：605-617.
[6] Lennon VA， Lindstrom JM， Seybold ME. Experimental autoimmune myasthenia： a model of myasthenia gravis in rats and guinea pigs[J].J Exp Med，1975 ，141（6）：1365-1375.
[7]单保恩，董青，李宏芬，等.非受体型酪氨酸激酶-Syk蛋白的提取与纯化[J].细胞与分子免疫学杂志，2004，20（2）：230-233.
[8] Stewart ZA， Pietenpol JA. Syk： a new player in the field of breast cancer[J].Breast Cancer Res， 2001；3（1）：5-7.
[9] Milani M， Ostlie N， Wang W， et al. T cells and cytokines in the pathogenesis of acquired myasthenia gravis[J].Ann N Y Acad Sci， 2003 Sep；998：284-307.
[10] 包忠蕾，闫晓波.重症肌无力动物模型的建立[J].中国神经免疫学和神经病学杂志，2010，17（1）：69-71.
[11]王国栋，李萍，陈靠山，等.多糖激活树突状细胞的免疫调节作用[J].细胞与分子免疫学杂志，2013，29，（2）：204-206.
作者简介：
大连医科大学附属第一医院神经内科，卢苗为硕士研究生。