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摘 要：采用高效液相色谱—荧光法（HPLC-FLD）检测鱼肉中两种氟喹诺酮类药物。鱼肉样品经磷酸盐缓冲溶液匀浆后转入离心管，离心并提取上清液，上清液过固相萃取柱用水淋洗，济干，用流动性（乙腈、0.05mol/L磷酸/三乙胺溶液（三乙胺调pH2.4）体积比20：80）定容。通过对鱼肉样品中氟喹诺酮类药物的检测表明该方法具有准确、快速、灵敏的特点。
关键词：高效液相色谱法；氟喹诺酮类药物；残留分析；鱼肉
氟喹诺酮类药物是喹诺酮类药物的第三代产品，它代指一族人工合成的具有6-氟-4-喹诺酮环基结构的广谱杀菌性抗菌剂，对革兰氏阳性菌和阴性菌、支原体、某些厌氧菌均有效，主要通过抑制细菌DNA螺旋酶作用，阻碍DNA合成而导致细菌死亡。因具抗菌谱广、高效、低毒、组织穿透力强等特点，目前氟喹诺酮类药物在医学和兽医学中应用广泛，但其残留可导致人体病原体的耐药性，而且有关氟喹诺酮类药物还有潜在的致癌性和遗传毒性，同时还容易使病菌产生耐药性，所以欧盟和北美等国家只批准恩诺沙星为动物专用的抗菌药了，环丙沙星已禁止在水产养殖业中使用。动物源性食品的安全性，对其残留量的检测越来越受到关注。目前，常用于氟喹诺酮类药物残留的检测方法可分为4大类：微生物法、仪器分析法、化学发光与电化学发光分析法及免疫分析法。其中仪器分析法常见的有高效液相色谱法、液-质联用分析法等；本文是用高效液相色譜-荧光法检测方法，用磷酸盐缓冲溶液作为提取液，可同时检测鱼肉中环丙沙星、恩诺沙星两种氟喹诺酮类药物，该方法操作方便快捷、节约成本，能够满足我国现行兽药残留检测分析的要求。
一、材料与方法
1.仪器与设备
高效液相色谱仪（配荧光检测器），高速匀浆均质器，离心机，天平，涡旋机，固相萃取柱，微孔滤膜。
2.材料与试剂
恩诺沙星、环丙沙星、浓磷酸、磷酸二氢钾、三乙胺、氢氧化钠、甲醇，实验室用水为高纯水。
3.方法
（1）溶液配制。5.0mol/L氢氧化钠溶液：取氢氧化钠饱和溶液28ml，加水稀释至100ml。0.05mol/L磷酸/三乙胺溶液：取浓磷酸3.4ml，用水稀释至1000ml，用三乙胺调PH至2.4。
磷酸盐缓冲溶液：取磷酸二氢钾6.8g，加水使溶解并稀释至500ml，用5mol/L氢氧化钠溶液调节PH至7.0。
（2）鱼肉样品处理。
①提取：取约500g鱼肉，用搅碎机搅碎混匀，称取2（ 0.05）g鱼肉，置50ml离心管中，加磷酸盐缓冲溶液10.0ml，10000r/min匀浆1min，匀浆液放入离心机中10000r/min、5min，取上清液，待用。用磷酸盐缓冲溶液10.0ml洗刀头及残渣，充分涡旋混匀，在放入离心机中10000r/min、5min，合并两次上清液，混匀，备用。
②净化：固相萃取柱先依次用甲醇、磷酸盐缓冲溶液各2ml预洗。取上清液5.0ml过柱，用水1.0ml淋洗，济干。用流动相1.0ml洗脱，济干，收集洗脱液。经滤膜过滤后作为进样溶液，供高效液相色谱法测定。
（3）色谱条件。
色谱柱：C18柱（5um，4.6×250mm）。
流动相：0.05mol/L磷酸/三乙胺溶液（三乙胺调pH2.4）体积比20：80，使用前经微孔滤膜过滤。
检测波长：254nm。
柱温：室温。
进样量：20ul。
（4）流动相的选择。
经②小节中经滤膜过滤后作为进样溶液，过滤至高效液相进样瓶中，进行高效液相测定分析。根据分离效果选择流动相。
（4）线性分析。分别配制0.02、0.05、0.1、0.2、0.5mol/l环丙沙星和恩诺沙星标准混合溶液，依次进样20ul进行分析。
二、结果与分析
流动相的选择。经过实验比较流动相乙腈、0.05mol/L磷酸/三乙胺溶液（三乙胺调pH2.4）与乙腈、0.01mol/L磷酸二氢钠（磷酸调PH2.4）的灵敏性，流动相乙腈、0.05mol/L磷酸/三乙胺溶液（三乙胺调pH2.4）对目标峰的响应最灵敏，加入三乙胺的目的是为了防止目标峰拖尾，所以最终确定流动相为乙腈、0.05mol/L磷酸/三乙胺溶液（三乙胺调pH2.4）。恩诺沙星、环丙沙星标准品谱图见图1，环丙沙星和恩诺沙星标准溶液线性范围内峰高见表1。
三、结语
本方法测定鱼肉中的环丙沙星、恩诺沙星的残留，检测条件稳定，可操作性强，应用简单方便。对农产品质量安全检测中心开展动物组织中兽药残留检测工作具有现实指导意义。
参考文献：
[1]蒋小武.浅析氟喹诺酮类兽药残留检测方法[J].中国畜牧兽医文摘，2011 ， 27 （3） ：188-190.
[2]朱莉萍， 朱涛， 武娜，等. 高效液相色谱法测定猪肉中氟喹诺酮类药物[J]. 肉类研究，2011（10）：29-31.
关键词：高效液相色谱法；氟喹诺酮类药物；残留分析；鱼肉
氟喹诺酮类药物是喹诺酮类药物的第三代产品，它代指一族人工合成的具有6-氟-4-喹诺酮环基结构的广谱杀菌性抗菌剂，对革兰氏阳性菌和阴性菌、支原体、某些厌氧菌均有效，主要通过抑制细菌DNA螺旋酶作用，阻碍DNA合成而导致细菌死亡。因具抗菌谱广、高效、低毒、组织穿透力强等特点，目前氟喹诺酮类药物在医学和兽医学中应用广泛，但其残留可导致人体病原体的耐药性，而且有关氟喹诺酮类药物还有潜在的致癌性和遗传毒性，同时还容易使病菌产生耐药性，所以欧盟和北美等国家只批准恩诺沙星为动物专用的抗菌药了，环丙沙星已禁止在水产养殖业中使用。动物源性食品的安全性，对其残留量的检测越来越受到关注。目前，常用于氟喹诺酮类药物残留的检测方法可分为4大类：微生物法、仪器分析法、化学发光与电化学发光分析法及免疫分析法。其中仪器分析法常见的有高效液相色谱法、液-质联用分析法等；本文是用高效液相色譜-荧光法检测方法，用磷酸盐缓冲溶液作为提取液，可同时检测鱼肉中环丙沙星、恩诺沙星两种氟喹诺酮类药物，该方法操作方便快捷、节约成本，能够满足我国现行兽药残留检测分析的要求。
一、材料与方法
1.仪器与设备
高效液相色谱仪（配荧光检测器），高速匀浆均质器，离心机，天平，涡旋机，固相萃取柱，微孔滤膜。
2.材料与试剂
恩诺沙星、环丙沙星、浓磷酸、磷酸二氢钾、三乙胺、氢氧化钠、甲醇，实验室用水为高纯水。
3.方法
（1）溶液配制。5.0mol/L氢氧化钠溶液：取氢氧化钠饱和溶液28ml，加水稀释至100ml。0.05mol/L磷酸/三乙胺溶液：取浓磷酸3.4ml，用水稀释至1000ml，用三乙胺调PH至2.4。
磷酸盐缓冲溶液：取磷酸二氢钾6.8g，加水使溶解并稀释至500ml，用5mol/L氢氧化钠溶液调节PH至7.0。
（2）鱼肉样品处理。
①提取：取约500g鱼肉，用搅碎机搅碎混匀，称取2（ 0.05）g鱼肉，置50ml离心管中，加磷酸盐缓冲溶液10.0ml，10000r/min匀浆1min，匀浆液放入离心机中10000r/min、5min，取上清液，待用。用磷酸盐缓冲溶液10.0ml洗刀头及残渣，充分涡旋混匀，在放入离心机中10000r/min、5min，合并两次上清液，混匀，备用。
②净化：固相萃取柱先依次用甲醇、磷酸盐缓冲溶液各2ml预洗。取上清液5.0ml过柱，用水1.0ml淋洗，济干。用流动相1.0ml洗脱，济干，收集洗脱液。经滤膜过滤后作为进样溶液，供高效液相色谱法测定。
（3）色谱条件。
色谱柱：C18柱（5um，4.6×250mm）。
流动相：0.05mol/L磷酸/三乙胺溶液（三乙胺调pH2.4）体积比20：80，使用前经微孔滤膜过滤。
检测波长：254nm。
柱温：室温。
进样量：20ul。
（4）流动相的选择。
经②小节中经滤膜过滤后作为进样溶液，过滤至高效液相进样瓶中，进行高效液相测定分析。根据分离效果选择流动相。
（4）线性分析。分别配制0.02、0.05、0.1、0.2、0.5mol/l环丙沙星和恩诺沙星标准混合溶液，依次进样20ul进行分析。
二、结果与分析
流动相的选择。经过实验比较流动相乙腈、0.05mol/L磷酸/三乙胺溶液（三乙胺调pH2.4）与乙腈、0.01mol/L磷酸二氢钠（磷酸调PH2.4）的灵敏性，流动相乙腈、0.05mol/L磷酸/三乙胺溶液（三乙胺调pH2.4）对目标峰的响应最灵敏，加入三乙胺的目的是为了防止目标峰拖尾，所以最终确定流动相为乙腈、0.05mol/L磷酸/三乙胺溶液（三乙胺调pH2.4）。恩诺沙星、环丙沙星标准品谱图见图1，环丙沙星和恩诺沙星标准溶液线性范围内峰高见表1。
三、结语
本方法测定鱼肉中的环丙沙星、恩诺沙星的残留，检测条件稳定，可操作性强，应用简单方便。对农产品质量安全检测中心开展动物组织中兽药残留检测工作具有现实指导意义。
参考文献：
[1]蒋小武.浅析氟喹诺酮类兽药残留检测方法[J].中国畜牧兽医文摘，2011 ， 27 （3） ：188-190.
[2]朱莉萍， 朱涛， 武娜，等. 高效液相色谱法测定猪肉中氟喹诺酮类药物[J]. 肉类研究，2011（10）：29-31.