【摘 要】
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目的 构建人微小RNA(miRNA,miR)-637慢病毒过表达载体,建立稳定过表达miR-637的甲状腺乳头癌TPC-1细胞株,检测其对细胞增殖的影响.方法 设计针对miR-637前体的过表达基因片段
【机 构】
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450052,郑州大学第一附属医院甲状腺外科河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室
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目的 构建人微小RNA(miRNA,miR)-637慢病毒过表达载体,建立稳定过表达miR-637的甲状腺乳头癌TPC-1细胞株,检测其对细胞增殖的影响.方法 设计针对miR-637前体的过表达基因片段,应用聚合酶链反应法(PCR)扩增目的基因片段,通过基因重组技术将目的基因片段插入GV369慢病毒载体中,进行PCR鉴定及DNA测序和比对分析,构建GV369-miR-637慢病毒表达载体.用慢病毒液感染TPC-1,建立稳定过表达miR-637的TPC-1细胞株.荧光显微镜下观察GV369-miR-637慢病毒表达载体的转染效果,反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测GV369-miR-637-TPC-1、GV369-NC-TPC-1和TPC-1 3组细胞中miR-637的表达水平,细胞计数试剂盒(CCK-8)检测各组细胞的增殖能力.结果 经限制性内切酶鉴定及DNA测序分析,成功构建GV369-miR-637慢病毒表达载体质粒.GV369-miR-637-TPC-1和GV369-NC-TPC-1细胞在荧光显微镜下均发出绿色荧光,并且转染效率高.GV369-miR-637-TPC-1组中miR-637的表达水平显著高于GV369-NC-TPC-1细胞组(45.32±3.85比2.78±1.15,P＜0.05),其增殖能力受到抑制.结论 成功构建过表达miR-637的TPC-1细胞株,其抑制细胞增殖.
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