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owen[1]首先将其命名为间充质干细胞（BM-MSCs)，最初认为它只能分化为同胚层的细胞，后来研究证实其分化潜能是超越胚层界限的。BM-MSCs属于多能干细胞，来源于中胚层，具有很强的多向分化潜能，具有干细胞的共性[2-3]。对BM-MSCs分化潜能的研究已成为国内外研究机构的热点。目前BM-MSCs向肝细胞的分化已有研究，但仍处于初步阶段。本文就BM-MSCs体外诱导分化为肝细胞的研究进展作一综述。
1 BM-MSCs的生物学特性
1.1 BM-MSCs的来源及形态
BM-MSCs从骨髓、脂肪组织、骨骼肌、成人外周血、血管周皮细胞、妊娠4-6个月羊水、胎儿的血和真皮组织、脐血中都可以分离得到间充质干细胞[4]，其中对BM-MSCs研究最充分最彻底。BM-MSCs表现出早期细胞的特点，呈均一的成纤维细胞形态，染色质疏松，核仁明显，核浆比例大，辐射状或漩涡状排列，可聚集成均匀的集落。
1.2 BM-MSCs的鉴定
鉴定BM-MSCs目前没有特异性的表型标志，研究从形态、表型及多分化功能来鉴定体外分离培养的BM-MSCs [5-6]，纯化的BM-MSCs表现为成纤维细胞梭形贴壁细胞，呈漩涡状、平行状或鱼群状生长； BM-MSCs的抗原表型，流式细胞仪检测不表达造血细胞CD14、CD34、CD45的标志，表达CD29、CD44、CD73、CD90、CDl06、CDl24、SH-2、SH-3、SH-3等；BM-MSCs具有跨胚层的多向分化，如成骨、成软骨、成脂肪，是BM-MSCs作为干细胞最基本特征[7]。故BM-MSCs常通过负性筛选和细胞多向分化，鉴定BM-MSCs。
1.3 BM-MSCs的分离培养
BM-MSCs在骨髓中含量很少，生理状态下20％为静止期细胞，所以BM-MSCs要应用于临床，其分离培养显得尤其重要。目前分离获取BM-MSCs的方法主要有4种[8-9]：全骨髓差异贴壁法、免疫磁珠法、密度梯度离心法、流式细胞仪分离法。全骨髓差异贴壁法获取BM-MSCs，操作简单，保存了骨髓环境中丰富的粘附分子和各种生长因子的营养作用及其他细胞成分的支持作用，通过换液去除非贴壁的血细胞和造血细胞，提高了原代培养的成功率。免疫磁珠法和流式细胞仪分离法分选程度高，但需联合多个表面标志，且分选过程中对细胞的生物活性影响较大。密度梯度离心法根据骨髓细胞成分的密度不同，应用Ficoll或淋巴细胞分离液Percoll进行分离BM-MSCs，但分离液对细胞都有一定的毒性作用，造成细胞损伤，影响细胞的活性，使BM-MSCs培养困难。采用全骨髓差异贴壁法分离培养BM-MSCs，第一代纯化可以达到92％，第二代纯化超过96％[10]。
2 BM-MSCs诱导分化为肝样细胞的实验研究
骨髓干细胞研究的升温，其替代或作为过渡肝移植、肝细胞移植、肝干细胞移植治疗终末期肝脏疾病越来越成为可能。目前，國内外众多机构对体内、外骨髓干细胞向肝细胞的横向分化做了大量的工作，使干细胞移植成为基础和临床研究的热点。
2.1 BM-MSCs体内诱导分化为肝样细胞的研究
自从Petersen等[11]报道大鼠骨髓中的某个细胞群体具有分化为肝样细胞和胆管上皮细胞的潜能。这一结果提示，根据干细胞所处微环境的不同，其分化方向亦有较大的可塑性。有研究报道BM-MSCs是应激状态下肝再生细胞的主要肝外来源[12]。Theise等[13]将雌性小鼠给予致死量放射线照射，并将雄性小鼠的骨髓移植到该雌性小鼠体内，实验结果发现在雌性小鼠肝脏有部分细胞表达Y染色体同时表达肝细胞标志ALBmRNA，认为移植的骨髓干细胞在小鼠中能分化为肝样细胞。动物肝损伤后其体内产生大量对肝细胞生长有利的因子，利用这一特殊内环境对BM-MSCs进行诱导分化。Terai等[14]首先建立CCL4诱导的小鼠肝硬化模型，然后从尾静脉注入lxl05个经绿色荧光蛋白(GFP)标记的BM-MSCs，4周后肝脏中有25％的细胞是BM-MSCs，并横向分化为能分泌ALB的肝样细胞。AvitaI等[15]采用免疫磁珠分离法从大鼠和人骨髓中分离出β2-m-/Thy-1+细胞，这些细胞同时表达其他肝细胞特异性标志物ALB、AFP、CK-18。Yukiko Saji[16]等鉴定了在肝损伤小鼠模型体内碱性成纤维生长因子能促进BM-MSCs分化为肝样细胞，并且提高了ALB的表达，且能在增殖过程中保留BM-MSCs的多向分化潜能。
2.2 BM-MSCs体外诱导分化为肝样细胞的研究
研究表明骨髓干细胞在体外能诱导分化为肝系细胞，调控肝再生的细胞因子包括：肝细胞生长因子(HGF)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、转化生长因子a(TGF-a)、肝细胞再生刺激因子(HSS)、抑瘤素M(0SM)等[17]。Oh等[18]在体外培养的大鼠骨髓细胞中加人HGF诱导BM-MSCs向肝样细胞诱导分化实验，经诱导后显微镜下可观察到肝细胞样形态，用免疫细胞化学法检测到ALB和CKl8。HGF它是一种普遍存在并具有多能性的细胞因子，对表达C-met的多种细胞的有丝分裂及塑形都具有刺激作用并通过与受体C-met相互作用而对多种细胞产生促有丝分裂作用，促进细胞增生，影响细胞迁移[19]。Oklumoto等[20]采用阴性选择磁场细胞分离系统得到丰富的BM-MSCs，将其与肝细胞共同培养7d后经RT-PCR检测出BM-MSCs分化为具有表达AFP和ALBmRNA的肝特异性标志的细胞。Lee KD[21]等采用两步法诱导方案，将骨髓来源的间充质干细胞分离后，首先接种于含20 ng/ml表皮生长因子(EGF)和10 ng/ml成纤维细胞生长因子-4(FGF-4)培养液中培养7d后改为肝细胞生长因子（HGF）和抑瘤素M（OSM），诱导培养2周后，表达ALB、CKl8，4周后开始分泌尿素，实验结果提示BM-MSCs诱导分化为有肝细胞功能的细胞。FGF被认为是肝细胞发生的初始生长因子。Schwartz RE等[22]从骨髓中分离出BM-MSCs，在培养体系中加入HGF、FGF-4等生长因子诱导后间充质干细胞向肝细胞分化。bFGF是一个肝素结合的多肤类丝裂源，广布于各种组织中，可促进胚胎肝脏的形成和发育，并具有广泛的生物活性，可影响细胞的粘附、增殖和分化，不仅能提高BM-MSCs的增殖速度及其寿命，且能在增殖过程中保留BM-MSCs的多向分化潜能。可见，提供适宜的诱导和微环境，BM-MSCs在体外能得到很好的扩增和定向分化为肝样细胞。
3 展望
目前对骨髓间充质细胞的研究还处于理论阶段，研究仍然以动物实验为主，要达到治疗水平的肝脏重建尚存在大量的问题需要解决，如何使BM-MSCs稳定地传代时又保持良好的分化潜能；如何寻找和鉴定MSCs所特有的细胞表面标志分子；诱导BM-MSCs的分子机制。开关基因是什么?分化中各种组织特异性生长因子。营养因子等各自起到何种作用。上述干细胞体外培养的安全性还值得进一步研究。随着对BM-MSCs研究的不断进展，有理由相信，BM-MSCs将替代成熟肝细胞而成为肝细胞移植或生物人工肝的一种新来源。
参考文献
[1]Owen M. Marrow stromal stem cells．Cell Sci Suppl, 1988, 10: 63-76
[2]李志勇, 田衛东, 刘磊, 等. 绿色荧光蛋白转基因小鼠骨髓间充质干细胞的多向分化潜能研究.华西口腔医学杂志, 2005, 23(2): 152-154.
[3]Stock P, Bruckner S, Ebensing S, et al. The generation of hepatocytes from mesenchymal stem cells and engraftment into murine liver Nat Protoc. 2010, 5(4): 365-368.
[4]Yumi A Fukuchi,Hideaki Nakajima, Daisuke Sugiyama.Huanm placenta derived cells have mesenchymal stem/progenitor cell potential．Stem cell, 2004, 22:649-658．
[5]Danet GH, LuongoJL, Butler G, et a1．C1 qRq defines a new human stem cell population with hematopoietic and hepatic potential．Proc Natl Acad Sci US A．2002Aug 6:99(16): 10441-5．Epub , 2002 Jul 24.
[6]蔡云峰, 闵军, 何劲松, 魏菁, 莫隽全, 陈积圣骨髓源性肝干细胞的确认及定向分化的实验研究．中国普通外科杂志, 2003；12:287.290.
[7]JiangYang, Reinhardt RL, et a1．[J].Nature, 2002, 418:41-49．
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[11]Petersen BE, Bowen WC, Patrene KD, et a1．Bone marrow as a potential source of hepatic oval cells[J]．Science, 1999, 284: 1168-1170．
[12]Okumoto K, Saito T, Hattori E, et a1．Differentiation of bone implication of the Notch signals in differentiation[J]. Biochem Biophys Res Commun,2003, 304(4): 69．
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[20]Borowiak M,Garratt AN,Wustefeld T, et al. Met provides essential signals for liver regeneration. Proc Natl Acad Sci USA. 2004 July 20; 101(29): 10608–10613.
[19]Okumoto K, Saito T, Hanttori E, et al．Differentiation ofbone marrow cells into cells that express liver-specific genes in vittro: Implicplcation of the notch signals in differentitation [J]. Biochem Biophys Res Com, 2003, 304(4): 692-696.
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[21]Lee KD, Kuo TK, Whang-Peng 3, et a1．In vitro hepatic different-tiation of human mesenchymal stem cells[J]．Hepatology, 2004, 40(6): 1275-1284．
[22]Schwanz RE, Reyes M, K00die L, et a1.Multipotent adult progenitor cells from bone marrow differentiate into functional hepatocytelike cells[J]. ClinInvest, 2002,109(10): 1291-1302
1 BM-MSCs的生物学特性
1.1 BM-MSCs的来源及形态
BM-MSCs从骨髓、脂肪组织、骨骼肌、成人外周血、血管周皮细胞、妊娠4-6个月羊水、胎儿的血和真皮组织、脐血中都可以分离得到间充质干细胞[4]，其中对BM-MSCs研究最充分最彻底。BM-MSCs表现出早期细胞的特点，呈均一的成纤维细胞形态，染色质疏松，核仁明显，核浆比例大，辐射状或漩涡状排列，可聚集成均匀的集落。
1.2 BM-MSCs的鉴定
鉴定BM-MSCs目前没有特异性的表型标志，研究从形态、表型及多分化功能来鉴定体外分离培养的BM-MSCs [5-6]，纯化的BM-MSCs表现为成纤维细胞梭形贴壁细胞，呈漩涡状、平行状或鱼群状生长； BM-MSCs的抗原表型，流式细胞仪检测不表达造血细胞CD14、CD34、CD45的标志，表达CD29、CD44、CD73、CD90、CDl06、CDl24、SH-2、SH-3、SH-3等；BM-MSCs具有跨胚层的多向分化，如成骨、成软骨、成脂肪，是BM-MSCs作为干细胞最基本特征[7]。故BM-MSCs常通过负性筛选和细胞多向分化，鉴定BM-MSCs。
1.3 BM-MSCs的分离培养
BM-MSCs在骨髓中含量很少，生理状态下20％为静止期细胞，所以BM-MSCs要应用于临床，其分离培养显得尤其重要。目前分离获取BM-MSCs的方法主要有4种[8-9]：全骨髓差异贴壁法、免疫磁珠法、密度梯度离心法、流式细胞仪分离法。全骨髓差异贴壁法获取BM-MSCs，操作简单，保存了骨髓环境中丰富的粘附分子和各种生长因子的营养作用及其他细胞成分的支持作用，通过换液去除非贴壁的血细胞和造血细胞，提高了原代培养的成功率。免疫磁珠法和流式细胞仪分离法分选程度高，但需联合多个表面标志，且分选过程中对细胞的生物活性影响较大。密度梯度离心法根据骨髓细胞成分的密度不同，应用Ficoll或淋巴细胞分离液Percoll进行分离BM-MSCs，但分离液对细胞都有一定的毒性作用，造成细胞损伤，影响细胞的活性，使BM-MSCs培养困难。采用全骨髓差异贴壁法分离培养BM-MSCs，第一代纯化可以达到92％，第二代纯化超过96％[10]。
2 BM-MSCs诱导分化为肝样细胞的实验研究
骨髓干细胞研究的升温，其替代或作为过渡肝移植、肝细胞移植、肝干细胞移植治疗终末期肝脏疾病越来越成为可能。目前，國内外众多机构对体内、外骨髓干细胞向肝细胞的横向分化做了大量的工作，使干细胞移植成为基础和临床研究的热点。
2.1 BM-MSCs体内诱导分化为肝样细胞的研究
自从Petersen等[11]报道大鼠骨髓中的某个细胞群体具有分化为肝样细胞和胆管上皮细胞的潜能。这一结果提示，根据干细胞所处微环境的不同，其分化方向亦有较大的可塑性。有研究报道BM-MSCs是应激状态下肝再生细胞的主要肝外来源[12]。Theise等[13]将雌性小鼠给予致死量放射线照射，并将雄性小鼠的骨髓移植到该雌性小鼠体内，实验结果发现在雌性小鼠肝脏有部分细胞表达Y染色体同时表达肝细胞标志ALBmRNA，认为移植的骨髓干细胞在小鼠中能分化为肝样细胞。动物肝损伤后其体内产生大量对肝细胞生长有利的因子，利用这一特殊内环境对BM-MSCs进行诱导分化。Terai等[14]首先建立CCL4诱导的小鼠肝硬化模型，然后从尾静脉注入lxl05个经绿色荧光蛋白(GFP)标记的BM-MSCs，4周后肝脏中有25％的细胞是BM-MSCs，并横向分化为能分泌ALB的肝样细胞。AvitaI等[15]采用免疫磁珠分离法从大鼠和人骨髓中分离出β2-m-/Thy-1+细胞，这些细胞同时表达其他肝细胞特异性标志物ALB、AFP、CK-18。Yukiko Saji[16]等鉴定了在肝损伤小鼠模型体内碱性成纤维生长因子能促进BM-MSCs分化为肝样细胞，并且提高了ALB的表达，且能在增殖过程中保留BM-MSCs的多向分化潜能。
2.2 BM-MSCs体外诱导分化为肝样细胞的研究
研究表明骨髓干细胞在体外能诱导分化为肝系细胞，调控肝再生的细胞因子包括：肝细胞生长因子(HGF)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、转化生长因子a(TGF-a)、肝细胞再生刺激因子(HSS)、抑瘤素M(0SM)等[17]。Oh等[18]在体外培养的大鼠骨髓细胞中加人HGF诱导BM-MSCs向肝样细胞诱导分化实验，经诱导后显微镜下可观察到肝细胞样形态，用免疫细胞化学法检测到ALB和CKl8。HGF它是一种普遍存在并具有多能性的细胞因子，对表达C-met的多种细胞的有丝分裂及塑形都具有刺激作用并通过与受体C-met相互作用而对多种细胞产生促有丝分裂作用，促进细胞增生，影响细胞迁移[19]。Oklumoto等[20]采用阴性选择磁场细胞分离系统得到丰富的BM-MSCs，将其与肝细胞共同培养7d后经RT-PCR检测出BM-MSCs分化为具有表达AFP和ALBmRNA的肝特异性标志的细胞。Lee KD[21]等采用两步法诱导方案，将骨髓来源的间充质干细胞分离后，首先接种于含20 ng/ml表皮生长因子(EGF)和10 ng/ml成纤维细胞生长因子-4(FGF-4)培养液中培养7d后改为肝细胞生长因子（HGF）和抑瘤素M（OSM），诱导培养2周后，表达ALB、CKl8，4周后开始分泌尿素，实验结果提示BM-MSCs诱导分化为有肝细胞功能的细胞。FGF被认为是肝细胞发生的初始生长因子。Schwartz RE等[22]从骨髓中分离出BM-MSCs，在培养体系中加入HGF、FGF-4等生长因子诱导后间充质干细胞向肝细胞分化。bFGF是一个肝素结合的多肤类丝裂源，广布于各种组织中，可促进胚胎肝脏的形成和发育，并具有广泛的生物活性，可影响细胞的粘附、增殖和分化，不仅能提高BM-MSCs的增殖速度及其寿命，且能在增殖过程中保留BM-MSCs的多向分化潜能。可见，提供适宜的诱导和微环境，BM-MSCs在体外能得到很好的扩增和定向分化为肝样细胞。
3 展望
目前对骨髓间充质细胞的研究还处于理论阶段，研究仍然以动物实验为主，要达到治疗水平的肝脏重建尚存在大量的问题需要解决，如何使BM-MSCs稳定地传代时又保持良好的分化潜能；如何寻找和鉴定MSCs所特有的细胞表面标志分子；诱导BM-MSCs的分子机制。开关基因是什么?分化中各种组织特异性生长因子。营养因子等各自起到何种作用。上述干细胞体外培养的安全性还值得进一步研究。随着对BM-MSCs研究的不断进展，有理由相信，BM-MSCs将替代成熟肝细胞而成为肝细胞移植或生物人工肝的一种新来源。
参考文献
[1]Owen M. Marrow stromal stem cells．Cell Sci Suppl, 1988, 10: 63-76
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