论文部分内容阅读
【摘 要】 目的：采用高效液相色谱法同时测定养心氏片中葛根素、大豆苷、丹参素、芦丁、延胡索乙素、淫羊藿苷、芹菜素、人参皂苷Rd、阿魏酸9个成分的含量。方法：采用Agilent Plus-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm， 5μm），检测波长：阿魏酸采用310 nm，其余8种成分采用254 nm，流动相为乙腈（A）和0.1%甲酸水（B），A相随时间的变化：5%～40%（0～35 min），40%（35～45 min）；流速1 mL/min；柱温25 ℃；进样量5 μL。结果：9个指标性成分葛根素、大豆苷、丹参素、芦丁、延胡索乙素、淫羊藿苷、芹菜素、人参皂苷Rd、阿魏酸，在35 min内实现完全分离，线性良好（r>0.9990）。方法学验证表明，日内日间精密度RSD<5%，加样回收率范围为98.91%～102.74%。结论：该方法简便、准确、实用性强，可用于养心氏片的质量控制。
【关键词】 养心氏片；高效液相色谱法；含量测定
【中图分类号】R284.1 【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2018）06-0028-04
Abstract：Objective To determine the contents of nine marker components， including puerarin， daidzin， tanshinol， rutin， tetrahydropalmatine， icariin， apigenin， ginsenoside-Rd， ferulic acid in Yangxinsihi Tablet by high performance liquid chromatography（HPLC）. Methods The HPLC condition was as follows： column： Agilent Plus-C18 （250 mm×4.6 mm， 5 μm）； The detective wavelength was set at 310nm for ferulic acid， and 254 nm for the other eight components. Mobile phase： A was ACN， B was 0.1% formic acid aqueous solution， the gradient of A phase： 5%～40%（0～35min）， 40%（35～45min）； flow rate： 1mL/min； temperature of column： 25℃； injection volume：5μL.Results Nine marker components， including puerarin， daidzin， tanshinol， rutin， tetrahydropalmatine， icariin， apigenin， ginsenoside-Rd， ferulic acid， were separated at baseline within 35 min with good linear （r>0.9990）. The result of intra-day and inter-day precisions were at normal range （RSD<5%）. Range of the recovery was between 98.91% and 102.74%.Conclusion The method is rapid， simple，accurate which can be used to control the quality of Yangxingshi Tablet.
Keywords：Yangxinsihi Tablet； HPLC； Determination
养心氏片是由十三味中药组成的复方制剂，处方包含黄芪、淫羊藿、黄连、炙甘草、党参、山楂、醋延胡索、丹参、地黄、灵芝、葛根、当归和人参。具有扶正固本、益气活血、行脉止痛的功效，常用于气虚血瘀型冠心病、心绞痛、心肌梗塞及合并高血脂、高血糖等症[1-2]。养心氏片所含的活性成分如黄酮类成分葛根素、大豆苷、芦丁、芹菜素均有明显的扩张冠状动脉，保护心肌缺氧性损伤的作用[3]；生物碱类成分延胡索乙素有镇静镇痛的作用[4]；酚酸类成分丹参素有活血化瘀的功效[5]。
目前养心氏片的研究多为临床应用方面的报道，与含量测定相关的研究多为其中单个成分的测定，如黄芪甲苷和葛根素的测定[6-9]，2015版《中国药典》含量测定项下仅有黄芪甲苷的HPLC测定。单个成分的测定作为养心氏片的质量控制不够全面。而由于组分复杂，同时测定其中的黄酮类、生物碱和酚酸类难度较大，目前亦未见相关报道。本研究采用高效液相色谱法同时测定了养心氏片中9个指标性成分，方法简便、准确，为养心氏片的质量控制及后期的作用机制研究提供基础。
1 仪器与材料
1.1 仪器 Agilent 1100高效液相色谱仪（含G1379A真空脱气机、G1311A四元泵、G1367A自动进样器、G1316A柱温箱、G1315B DAD检测器，美国安捷伦公司）；KUDOS- SK2200H超声发生器（上海科导超声仪器公司）；METTLER AE240型十万分之一电子天平（德国梅特勒公司）。
1.2 材料 葛根素（批号：110752-201615）、大豆苷（批号：111738-201603）、丹参素（批号：110855-201614）、芦丁（批号：100080-201610）、延胡索乙素（批号：110726-201618）、淫羊藿苷（批号：110737-201516）、芹菜素（批号：111901-201603）、人参皂苷Rd（批号：111818-201603）、阿魏酸（批号：110773-201614）购自中国食品药品检定研究院（纯度>98%）；养心氏片（批号：150406，上海医药集团青岛国风药业股份有限公司）；色谱级甲醇购自Burdick&Jackson公司，色谱级乙腈购自Merck公司，色谱级甲酸购自Fluka公司，水为纯化水，其余试剂为分析纯。 2 方法和结果
2.1 溶液的配制
2.1.1 对照品溶液 如表1所示，精密称取如下样品于2 mL 量瓶中，加入2 mL甲醇定容，作为对照品储备液，存于4 ℃冰箱，待用。
2.1.2 标准曲线的配制 精密吸取上述对照品储备溶液各500 μL到10 mL 量瓶中，用甲醇定容，混匀，按照1∶2∶4∶8∶16∶32比例逐级稀释，制得标曲溶液。
2.1.3 样品溶液的制备 取2片养心氏片样品，剥除包衣放进研钵碾碎，精密称取1g置25mL量瓶中，加甲醇定容，超声30 min，补足失重，过0.22 μm微孔滤膜，制得样品溶液。
2.2 色谱条件 色谱柱：Agilent Plus-C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流速：1.0 mL/min；流动相：A乙腈- B水（含0.1%甲酸），A相随时间的变化：5%～40%（0～35 min），40%（35～45 min）；检测波长：254 nm、310 nm；柱温：25 ℃；进样量：5 μL；分析时间：35 min；柱后平衡时间：10 min。混合对照品、养心氏片样品的HPLC色谱图如图1所示。
2.3 线性关系考察 养心氏片中各化合物的标准曲线、线性范围及相关系数见表2。
2.4 精密度试验 取2.1.1项下制备的系列混合对照品溶液，在1 d内连续进样6次以及连续3d每天进样3次，根據所得峰面积分别考察日内和日间精密度。结果9个指标性成分的日内、日间精密度RSD均小于5%，表明该方法的精密度良好。
2.5 定量限和检测线考察 将9个对照品溶液依次进行稀释，以信噪比10∶1时，确定其最低定量限；以信噪比3：1时，确定其最低检测限。9个指标性成分的最低定量限分别为5.00、5.50、8.50、8.00、6.25、8.00、5.50、6.00、5.00μg/mL；最低检测限分别为2.50、2.75、4.25、4.00、3.13、4.00、2.25、3.00、2.50μg/mL。
2.6 稳定性实验 取制备的养心氏片样品溶液，分别在0、2、4、6、8、12、24 h测定9个成分的峰面积，考察其稳定性。结果9个成分峰面积的RSD分别为2.25%、1.23%、3.84%、4.26%、1.02%、2.52%、1.37%、1.28%、4.63%，表明供试品溶液在24 h内稳定。
2.7 重复性试验 精密称取同一批次养心氏片1g，共6份，按2.1.3项下方法，分别制成样品溶液进样分析。结果，养心氏片中9个成分含量的RSD均小于5%，表明该方法的重复性良好。
2.8 加样回收率实验 精密称取同一批次养心氏片0.5 g，共6份，分别加入对照品一定量 （样品中各成分含量的100%），按2.1.3项下方法制备，进样分析，计算回收率。9个成分的加样回收率和RSD（n=6）分别为101.42%（RSD=1.48%）、102.74%（RSD=3.87%）、98.91%（RSD=1.67%）、199.35%（RSD=2.58%）、99.27%（RSD=3.27%）、98.59%（RSD=2.73%）、100.32%（RSD=3.42%）、102.53%（RSD=1.17%）、100.41%（RSD=3.63%），回收率结果良好。
2.9 样品测定 养心氏片中各化合物的含量通过线性方程计算。见表3。
3 讨论
在色谱柱的选择上，考虑到待测成分较多，极性差别大，为了提高分离度，选用了250 mm长柱进行分析。由于同时测定组分较多，未能保证所有峰分离度均>1.5，其中葛根素和芦丁分离度>1.2，考虑到两者含量较高，为指标性成分，纳入了测定项，后期考虑用MS法准确定量。
在流动相的选择上，因各成分的参考流动相比例不同，采用了乙腈-水体系，梯度洗脱，从结果看，各成分可同时检测，分离度良好。在水相中加入甲酸可以防止葛根素、丹参素等成分出现拖尾峰，还可以抑制样品解离[10]。在检测波长的选择上，由于各成分的最大吸收波长各不相同，为了统一测定条件，并考虑到阿魏酸的特征吸收，同时选择了254 nm和310 nm两个波长，其中310 nm测定阿魏酸，254 nm测定其余8个成分。
由样品测定结果可见，养心氏片中多个活性成分含量稳定，其中治疗气虚血瘀的药如丹参、人参和葛根中所含的丹参素、人参皂苷Rd、葛根素的含量较高，符合本制剂的组方特点。本研究可同时测定养心氏片9个指标性成分的含量，方法简单，稳定可靠，可用于养心氏片的质量控制。
参考文献
[1]严冬， 钱玉良，唐蜀华. 养心氏片治疗气虚血瘀型冠心病心律失常疗效观察[J]. 南京中医药大学学报， 2006， 22（5）： 323-325.
[2]崔燕， 张辉，庄婕. 养心氏片治疗心绞痛及冠心病临床试验资料研究[J]. 食品与药品， 2013， 15（4）： 293-295.
[3]高翠英， 仇同革. 养心氏片对冠心病治疗效果的观察[J]. 实用心脑肺血管病杂志， 2010， 18（12）： 1801-1802.
[4]张鑫. 养心氏片长期治疗慢性稳定型心绞痛（气虚血瘀证）的临床研究[D].济南：山东中医药大学， 2014.
[5]张为. 养心氏片治疗冠心病慢性心力衰竭气虚血瘀证的临床研究[D].北京：北京中医药大学， 2007.
[6]张临通. 养心氏胶囊的质量标准研究[J].北京：中医研究， 2008， 21（9）： 20-24.
[7]杨雪萍，袁红英，孙昕，等. HPLC法测定养心氏片中葛根素的含量[J]. 实用医药杂志， 2010， 27（9）： 810-811.
[8]张春辉， 吴爱英，杨晓云. 薄层扫描法测定养心氏片中黄芪甲苷的含量[J]. 中国医院药学杂志， 2002， 22（2）： 91-92.
[9]孙忠敏. HPLC-ELSD法测定养心氏片中黄芪甲苷的含量[J]. 海峡药学， 2005， 17（4）： 75-76.
[10]王静， 徐艳红. 伪品养心氏片鉴别[J]. 时珍国医国药， 2000， 11（5）： 418-419.
【关键词】 养心氏片；高效液相色谱法；含量测定
【中图分类号】R284.1 【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2018）06-0028-04
Abstract：Objective To determine the contents of nine marker components， including puerarin， daidzin， tanshinol， rutin， tetrahydropalmatine， icariin， apigenin， ginsenoside-Rd， ferulic acid in Yangxinsihi Tablet by high performance liquid chromatography（HPLC）. Methods The HPLC condition was as follows： column： Agilent Plus-C18 （250 mm×4.6 mm， 5 μm）； The detective wavelength was set at 310nm for ferulic acid， and 254 nm for the other eight components. Mobile phase： A was ACN， B was 0.1% formic acid aqueous solution， the gradient of A phase： 5%～40%（0～35min）， 40%（35～45min）； flow rate： 1mL/min； temperature of column： 25℃； injection volume：5μL.Results Nine marker components， including puerarin， daidzin， tanshinol， rutin， tetrahydropalmatine， icariin， apigenin， ginsenoside-Rd， ferulic acid， were separated at baseline within 35 min with good linear （r>0.9990）. The result of intra-day and inter-day precisions were at normal range （RSD<5%）. Range of the recovery was between 98.91% and 102.74%.Conclusion The method is rapid， simple，accurate which can be used to control the quality of Yangxingshi Tablet.
Keywords：Yangxinsihi Tablet； HPLC； Determination
养心氏片是由十三味中药组成的复方制剂，处方包含黄芪、淫羊藿、黄连、炙甘草、党参、山楂、醋延胡索、丹参、地黄、灵芝、葛根、当归和人参。具有扶正固本、益气活血、行脉止痛的功效，常用于气虚血瘀型冠心病、心绞痛、心肌梗塞及合并高血脂、高血糖等症[1-2]。养心氏片所含的活性成分如黄酮类成分葛根素、大豆苷、芦丁、芹菜素均有明显的扩张冠状动脉，保护心肌缺氧性损伤的作用[3]；生物碱类成分延胡索乙素有镇静镇痛的作用[4]；酚酸类成分丹参素有活血化瘀的功效[5]。
目前养心氏片的研究多为临床应用方面的报道，与含量测定相关的研究多为其中单个成分的测定，如黄芪甲苷和葛根素的测定[6-9]，2015版《中国药典》含量测定项下仅有黄芪甲苷的HPLC测定。单个成分的测定作为养心氏片的质量控制不够全面。而由于组分复杂，同时测定其中的黄酮类、生物碱和酚酸类难度较大，目前亦未见相关报道。本研究采用高效液相色谱法同时测定了养心氏片中9个指标性成分，方法简便、准确，为养心氏片的质量控制及后期的作用机制研究提供基础。
1 仪器与材料
1.1 仪器 Agilent 1100高效液相色谱仪（含G1379A真空脱气机、G1311A四元泵、G1367A自动进样器、G1316A柱温箱、G1315B DAD检测器，美国安捷伦公司）；KUDOS- SK2200H超声发生器（上海科导超声仪器公司）；METTLER AE240型十万分之一电子天平（德国梅特勒公司）。
1.2 材料 葛根素（批号：110752-201615）、大豆苷（批号：111738-201603）、丹参素（批号：110855-201614）、芦丁（批号：100080-201610）、延胡索乙素（批号：110726-201618）、淫羊藿苷（批号：110737-201516）、芹菜素（批号：111901-201603）、人参皂苷Rd（批号：111818-201603）、阿魏酸（批号：110773-201614）购自中国食品药品检定研究院（纯度>98%）；养心氏片（批号：150406，上海医药集团青岛国风药业股份有限公司）；色谱级甲醇购自Burdick&Jackson公司，色谱级乙腈购自Merck公司，色谱级甲酸购自Fluka公司，水为纯化水，其余试剂为分析纯。 2 方法和结果
2.1 溶液的配制
2.1.1 对照品溶液 如表1所示，精密称取如下样品于2 mL 量瓶中，加入2 mL甲醇定容，作为对照品储备液，存于4 ℃冰箱，待用。
2.1.2 标准曲线的配制 精密吸取上述对照品储备溶液各500 μL到10 mL 量瓶中，用甲醇定容，混匀，按照1∶2∶4∶8∶16∶32比例逐级稀释，制得标曲溶液。
2.1.3 样品溶液的制备 取2片养心氏片样品，剥除包衣放进研钵碾碎，精密称取1g置25mL量瓶中，加甲醇定容，超声30 min，补足失重，过0.22 μm微孔滤膜，制得样品溶液。
2.2 色谱条件 色谱柱：Agilent Plus-C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流速：1.0 mL/min；流动相：A乙腈- B水（含0.1%甲酸），A相随时间的变化：5%～40%（0～35 min），40%（35～45 min）；检测波长：254 nm、310 nm；柱温：25 ℃；进样量：5 μL；分析时间：35 min；柱后平衡时间：10 min。混合对照品、养心氏片样品的HPLC色谱图如图1所示。
2.3 线性关系考察 养心氏片中各化合物的标准曲线、线性范围及相关系数见表2。
2.4 精密度试验 取2.1.1项下制备的系列混合对照品溶液，在1 d内连续进样6次以及连续3d每天进样3次，根據所得峰面积分别考察日内和日间精密度。结果9个指标性成分的日内、日间精密度RSD均小于5%，表明该方法的精密度良好。
2.5 定量限和检测线考察 将9个对照品溶液依次进行稀释，以信噪比10∶1时，确定其最低定量限；以信噪比3：1时，确定其最低检测限。9个指标性成分的最低定量限分别为5.00、5.50、8.50、8.00、6.25、8.00、5.50、6.00、5.00μg/mL；最低检测限分别为2.50、2.75、4.25、4.00、3.13、4.00、2.25、3.00、2.50μg/mL。
2.6 稳定性实验 取制备的养心氏片样品溶液，分别在0、2、4、6、8、12、24 h测定9个成分的峰面积，考察其稳定性。结果9个成分峰面积的RSD分别为2.25%、1.23%、3.84%、4.26%、1.02%、2.52%、1.37%、1.28%、4.63%，表明供试品溶液在24 h内稳定。
2.7 重复性试验 精密称取同一批次养心氏片1g，共6份，按2.1.3项下方法，分别制成样品溶液进样分析。结果，养心氏片中9个成分含量的RSD均小于5%，表明该方法的重复性良好。
2.8 加样回收率实验 精密称取同一批次养心氏片0.5 g，共6份，分别加入对照品一定量 （样品中各成分含量的100%），按2.1.3项下方法制备，进样分析，计算回收率。9个成分的加样回收率和RSD（n=6）分别为101.42%（RSD=1.48%）、102.74%（RSD=3.87%）、98.91%（RSD=1.67%）、199.35%（RSD=2.58%）、99.27%（RSD=3.27%）、98.59%（RSD=2.73%）、100.32%（RSD=3.42%）、102.53%（RSD=1.17%）、100.41%（RSD=3.63%），回收率结果良好。
2.9 样品测定 养心氏片中各化合物的含量通过线性方程计算。见表3。
3 讨论
在色谱柱的选择上，考虑到待测成分较多，极性差别大，为了提高分离度，选用了250 mm长柱进行分析。由于同时测定组分较多，未能保证所有峰分离度均>1.5，其中葛根素和芦丁分离度>1.2，考虑到两者含量较高，为指标性成分，纳入了测定项，后期考虑用MS法准确定量。
在流动相的选择上，因各成分的参考流动相比例不同，采用了乙腈-水体系，梯度洗脱，从结果看，各成分可同时检测，分离度良好。在水相中加入甲酸可以防止葛根素、丹参素等成分出现拖尾峰，还可以抑制样品解离[10]。在检测波长的选择上，由于各成分的最大吸收波长各不相同，为了统一测定条件，并考虑到阿魏酸的特征吸收，同时选择了254 nm和310 nm两个波长，其中310 nm测定阿魏酸，254 nm测定其余8个成分。
由样品测定结果可见，养心氏片中多个活性成分含量稳定，其中治疗气虚血瘀的药如丹参、人参和葛根中所含的丹参素、人参皂苷Rd、葛根素的含量较高，符合本制剂的组方特点。本研究可同时测定养心氏片9个指标性成分的含量，方法简单，稳定可靠，可用于养心氏片的质量控制。
参考文献
[1]严冬， 钱玉良，唐蜀华. 养心氏片治疗气虚血瘀型冠心病心律失常疗效观察[J]. 南京中医药大学学报， 2006， 22（5）： 323-325.
[2]崔燕， 张辉，庄婕. 养心氏片治疗心绞痛及冠心病临床试验资料研究[J]. 食品与药品， 2013， 15（4）： 293-295.
[3]高翠英， 仇同革. 养心氏片对冠心病治疗效果的观察[J]. 实用心脑肺血管病杂志， 2010， 18（12）： 1801-1802.
[4]张鑫. 养心氏片长期治疗慢性稳定型心绞痛（气虚血瘀证）的临床研究[D].济南：山东中医药大学， 2014.
[5]张为. 养心氏片治疗冠心病慢性心力衰竭气虚血瘀证的临床研究[D].北京：北京中医药大学， 2007.
[6]张临通. 养心氏胶囊的质量标准研究[J].北京：中医研究， 2008， 21（9）： 20-24.
[7]杨雪萍，袁红英，孙昕，等. HPLC法测定养心氏片中葛根素的含量[J]. 实用医药杂志， 2010， 27（9）： 810-811.
[8]张春辉， 吴爱英，杨晓云. 薄层扫描法测定养心氏片中黄芪甲苷的含量[J]. 中国医院药学杂志， 2002， 22（2）： 91-92.
[9]孙忠敏. HPLC-ELSD法测定养心氏片中黄芪甲苷的含量[J]. 海峡药学， 2005， 17（4）： 75-76.
[10]王静， 徐艳红. 伪品养心氏片鉴别[J]. 时珍国医国药， 2000， 11（5）： 418-419.