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摘 要：SSR标记具有共显性、高多态性、位点专化性、稳定性好、操作技术简单等特点，是十分理想的分子标记。随着一些简单、经济和高效的ssR分离技术的发展，SSR标记已逐渐在植物病原菌中被开发和利用。本文综述了植物病原菌中SsR标记的主要开发策略及其应用进展。
关键词：植物病原菌；SSR标记；开发；利用
中图分类号：S 432．1
简单重复序列(simple sequence repeats，SSRs)又称微卫星(microsatellites)，是基因组序列中以1～6个核苷酸为基本重复单元的串联重复DNA序列，普遍存在于真核和原核生物基因组的编码区和非编码区。sSR分子标记具有高多态性、多等位性、共显性、分类学专化性、稳定性好、操作技术简单等特点，是十分有用的遗传标记，目前已广泛应用于动、植物遗传图谱构建、系统发育和遗传多样性研究、品种及基因型鉴定、目的基因及QTL的标记和标记辅助选择育种等研究。然而，常规的SSR标记开发一般是通过构建、筛选基因文库和测序等步骤完成，不但花费大，而且费工费时，因而限制了它在植物病原菌中的应用。近几年来一些新的SSR分离技术被发展，这些技术克服了传统SSR分离方法的缺点，简单有效，使植物病原菌SSR标记开发与应用成为可能。一些包括卵菌、真菌、线虫和细菌在内的植物病原菌SSR标记被陆续开发(表1)，并应用到研究的许多方面。
1 植物病原菌中SSR标记开发的主要策略
1．1 基于传统SSR标记开发技术
传统的SSR分子标记方法由Rassmann等发明。利用该方法开发SSR需要构建和筛选基因组文库，花费大量的人力、物力和财力，且效率较低，因此在植物病原菌中应用很少。迄今，仅有Lepto-sphaeria maculans、Sclerotinia sclerotiorum和Phytophthora in festans少量的SSR标记是通过该方法建立的。如Sirjusingh等通过构建S.sclero-tiorum基因组文库，用T4多核苷酸激酶和PrATP末端标记的含有(TC)10(TG)10、(TGTA)6TG、CT(ATCT)6、CT(CCT)5和(CAC)5CA寡核苷酸探针进行杂交筛选，阳性克隆用M13通用引物扩增，并测序插入片段，获得20多个SSR标记。
1．2 利用SSR富集文库筛选SSR标记
直接从基因组文库中筛选SSR位点效率较低。为了提高筛选效率，一些研究者建议通过构建SSR富集文库筛选SSR标记。富集SSR文库的构建方法主要有两种，一种是基于引物延伸的方法，一种是选择性杂交方法，这两种方法zane等已进行了详细综述。由于SSR筛选效率的显著提高，目前多数植物病原菌的SSR标记是通过构建SSR富集文库获得的。
基于引物延伸构建SSR富集文库的方法主要有两种。这两种方法首先都是将小基因组DNA片段插入到噬菌体质粒嵌合体或噬菌体载体构建单链DNA(ssDNA)初级文库，接着以ssDNA作为模板进行引物延伸反应，所用引物为特异重复寡核苷酸，只有含有目标重复序列的载体中产生双链DNA产物，但在恢复引物延伸产物程序上两种方法存在差异。用引物延伸的方法构建SSR富集文库开发SSR标记在动、植物中有一些应用，在植物病原菌中目前只有Chen等用该方法分离了几个Phialopho-ra gregata的SSR标记。
不同于引物延伸方法，选择性杂交构建SSR富集文库是将小基因组DNA片段连接到已知的DNA序列、载体或接头上，接着与固定在尼龙膜上的SSR探针或结合在链霉亲合素包被磁珠上的生物素标记SSR探针杂交，杂交后用洗液洗几次去除非特异性结合片段，再将DNA片段洗脱下来，PCR扩增恢复片段浓度，最后将DNA克隆到合适的载体上获得SSR富集文库。目前，绝大多数植物病原菌的SSR标记是通过该方法获得的。如Prospero等通过选择性杂交方法构建Phytophthora ramorum的(AC)13、(AG)13、(ACG)6、(ACC)8、(ACC)8和(AAT)12的SSR富集文库。用RsaI和BstUI限制酶消化基因组DNA，片段连接到superSNX后与3’端标记生物素并结合在磁珠上的寡核苷酸微卫星杂交，回收阳性片段，用SuperSNX24上游引物扩增，回收纯化片段再杂交，二次富集的PCR产物克隆到TOPOTA载体上，阳性重组克隆用M13的上下游引物扩增，500～1 000 bp的片段用M13的上游引物测序，搜索基元重复数多于6个的SSRs，用M13的下游引物反向测序，用经拼接好的序列设计引物，扩增14～30个P.ramorum菌株，获得多态性SSR标记。
1．3 基于ISSR-PCR的方法分离SSR
Zietkiewicz等发明了ISSR(简单序列重复间隔区)分子标记。用ISSR引物对全基因组DNA扩增，克隆测序后一般可以得到SSR序列一端的引物，即正向引物，采用染色体步行法进行第2次克隆测序设计引物，从而获得反向引物。ISSR-PCR分离SSR方法避免了文库的构建与筛选，有更强的目的性，大大缩短了时间，降低了研究费用，目前在植物病原菌中也有一定的应用。如Steimel等利用ISSR-PCR技术分离Cera-tocystis fimbiata中的SSR位点。他们用纯化的基因组DNA建立染色体步行文库，设计5’端锚定3～4个核苷酸的简并SSR引物DBV(CAT)8、DBH(CAG)8、BBH(AAG)8和BDB(GACA)。加接头引物AP1扩增文库，再将扩增产物连接T-载体克隆，提取重组质粒，限制酶酶切后电泳，筛选含有预期片段的质粒，测序阳性克隆，对合适的重复序列片段根据其3’侧翼序列设计两个反向步移引物进行扩增，得到上游片段，测序后再设计1个上游引物，扩增SSR片段，通过该方法共筛选出10个SSR位点。
1．4 利用FIASCO方法分离SSR标记
Zane于2002年提出了结合AFLP技术的SSR序列分离策略，即FIASCO法(利用AFLP快速分离重复序列)。该方法与选择性杂交相似，但步骤简单，成本低、效率高，步骤包括酶切基因组DNA，加上AFLP接头，特异性引物进行第1次PCR扩增，用生物素标记的探针与扩增产物杂交，经3次非 严谨性和3次严谨性洗脱去除非特异性杂交，变性分离DNA片段进行第2次扩增，PCR产物连接载体转化克隆测序。该方法在植物病原菌中也开始得到应用，如Hunter等用该方法开发Mycosphaerelanubilosa的SSR标记，其具体步骤为先用Mse I消化M.nubilosa基因组DNA，加AFLP接头进行PCR扩增，将扩增片段与(ATCC)5、(GATA)6、(AG)10(GT)17、(TC)15和(CA)15探针杂交，磁珠富集目的片段，连接T-载体，转化大肠杆菌，再扩增阳性菌落，选择100～500 bp的片段，纯化后直接测序以确定SSR的存在，试验共测定了126个克隆，其中15个含有SSR片段。Nakabonge等也用该方法分离了Cryphonectria eucalypti中的SSR标记。
1．5 利用DNA序列信息开发微卫星标记
虽然植物病原菌基因组研究起步较晚，但发展很快。目前，GenBank中已包含了数十种不同类型植物病原菌的EST序列或其他不同类型的DNA序列。除大量的植物病毒外，已有近40种植物病原细菌、15种植物病原菌真菌和3种疫霉菌全基因组测序已经完成或正在进行(http://cpgr.tigr.org)。一些原核生物全基因组序列中非冗余sSR数据库也已建立。因此，从DNA序列中特别是从EST中发掘SSR已经成为开发SSR标记快速、廉价、有效的途径。
最近，笔者对GenBank中28，197条Phytoph-thora sojae EST进行了SSR分析，在1 322条EST中发现1 408个SSR，选择243个SSR位点设计引物，用10个菌株基因组DNA进行PCR扩增，有193对引物(79.4％)能有效扩增，其中93对引物在10个大豆疫霉菌分离物间扩增出多态性。Feau等从Septoria musiva的117条非冗余EST序列中开发了5个多态性ssR标记。Lees等通过搜索EST和BAC序列寻找P.in festans的SSR标记，获得11个多态性SSR标记。
Grunwald等对两个测序完成的疫霉菌P.sojae(95 Mb)和P.ramorum(65 Mb)全基因组序列中2～6 bp重复的SSR进行了分析，在这两个菌的全基因组序列中分别发现了2 128个和1 000个SSRs。在P.ramorum全基因组序列中，Ivors等选出102个位点设计引物并用8个菌株进行检测，有62个(60.8％)能有效扩增，其中32个(51.6％)具有多态性；在P.sojae全基因组序列中，笔者选择了260个SSR位点设计引物，用4株P.sojae检测，发现有208对(80％)引物能有效扩增，115对(55.3％)在4个菌株之间显示多态性。
1．6 用亲缘关系相近物种的SSR标记
SSR侧翼序列具有保守性，有些物种的一些SSR引物能够在其近缘种、属中有效扩增。SSR标记在物种间的通用性取决于SSR侧翼序列的保守程度和SSR进化的稳定性。一些研究表明，基因组SSR标记的通用性一般较差，而EST-SSR标记的通用性较高。在植物病原菌中，一些种的SSR引物已证明能够在其近缘种中扩增(表1)。但为了获得一个新物种的专化性SSR标记，用近缘种SSR引物扩增获得的产物需要测序和重新设计引物。Lefrancois等用Armillaria ostoyae的SSR引物扩增A.gallica基因组DNA，克隆、测序扩增片段，获得6个含有SSR基元的片段，在这6个SSRs中，1个A.ostoyae引物直接用于A.gallica的扩增，其他5个需要重新设计引物以提高在A.ostoyae中的扩增效果。
此外，还有两种基于RAPD富集SSR的开发策略被发展，一种是将RAPD随机扩增条带与带有标记的微卫星探针杂交的RAHM(random amplifiedhybridization microsatellite)，一种利用重复锚定随机引物抑或将RAPD产物经克隆再用特异性的ssR探针及载体引物筛选阳性克隆的PIMA(PcRisolation of microsatellite arrays)，但这两种方法在植物病原菌中的应用目前没有报道。
2 SSR标记在植物病原菌中的应用
2．1 植物病原菌种群变异及进化研究
由于SSR标记为共显性，多态性高，特别是SSR位点具有分类学专化性，能够用于也许含有非目标微生物DNA的样品，因此，SSR是研究植物病原菌遗传变异与进化最理想的分子标记。
沈瑛等用7个SSR标记对Magnaporthegrisea的遗传多样性进行分析，获得了一些有用的信息。如对来自湖南烟溪稻瘟病病圃连续4年分离的105个稻瘟病菌分离物分析表明，同一病圃内稻瘟病菌存在丰富的遗传变异，但亲缘关系明确，105个分离物可划分为6个不同的系谱群，其中一一些系谱群在年度之间也存在遗传多样性；而对不同地理来源的稻瘟病菌分析表明，稻瘟病菌遗传多样性丰富而且亲缘关系复杂，研究的国外菌株具有与国内菌株相同的遗传背景和亲缘关系，国内菌株多样性不存在地理上的差异。Ivors等用SSR标记对P.ramorum的群体结构进行了深入分析，发现来自苗圃的病原菌遗传多样性显著高于森林中病原菌的遗传多样性，美国森林中只存在两个密切相关的基因型，而欧洲苗圃的病原菌群体遗传结构中等复杂，包括多个密切相关的基因型，多位点分析表明美国森林中的种群为无性繁殖，可能是某个单一引入个体的后代。Enjalbert等根据ssR标记和毒力分析结果将法国Puccinia striiformis f.sp.tritici种种群划分为南、北两个亚种群，其中北部种群属于西北欧种群，而南部种群最有可能与地中海种群相关，这两个亚种群来源于很早以前的两个分化的无性系谱。
此外，SSR标记也用于Dialodia pinea(=Sphaeropsis sapinea)、P.infestans、Sclerotin-ia sclerotiorum、Venturia inaequalis等植物病原菌的遗传多样性、遗传分化和进化研究。
2．2 遗传图谱的构建及无毒基因定位
目前，SSR标记已应用于M.grisea遗传图谱的构建和无毒基因定位。Kaye等首先将23个SSR标记整合到M.grisea的遗传图谱上，这些标记在M.grisea的7条染色体上都有分布，有的定位在缺少标记的区域。王艳丽等利用M.grisea菌株CH63和TH16杂交组合构建了包含100多个SSR 位点、覆盖7条染色体的遗传图谱并对6个无毒基因进行了初步定位。Kaye等将134个SSR标记填充到M.grisea的遗传图谱上，标记分布在6条染色体上，平均遗传距离为1 cm。最近，Ma等也利用ssR标记鉴定和精细作图了一个新的M.grisea无毒基因AvrPi15，SSR标记将该基因定位在M.grisea第6染色体上，在此基础上进一步获得了2个与该基因共分离的候选无毒基因标记，为该基因克隆奠定了基础。
2．3 用于病害流行学的研究
Gobbin等研究了Plasmopara viticola的二次侵染在霜霉病流行中的重要作用。用4个SSR标记分析了来自18个地方的4 685个病样，结果显示70％的基因型只出现1次，14％的基因型出现2次，只有7个基因型出现了50次以上，这说明P.viticola在流行中有许多基因类型，流行是多种基因型综合作用的结果，每一种在侵染中只有很小的作用，这种结论与前人结论向背，即孢子囊可以远距离传播，单种基因型造成流行。群体遗传学的研究可以为植物病害空间、时间的流行动态研究提供依据，分子标记又为遗传学的研究提供了便利的工具，特别是方便有效的分子标记。
2．4 用于病原菌鉴定及交配型、种内型的区分
SSR标记也是一种鉴定植物病原菌的种、菌株类型、菌株交配型、形态型及不同病原谱系的理想分子标记。Ivors等用12对SSR引物对分别来自美国和欧洲的大量P.ramorum、2株P.alateralis和2株P.hibernalis进行分析，发现只有1对引物在P.alateralis和P.hibernalis有扩增，且片段长度与P.ramorum中不同，认为SSR标记可用于P.ramorum的鉴定。Prospero等用P.ramorum基因组的ssR标记分析该菌两种交配型(A1、A2)，发现22个ssR位点中有7个在两个交配型中出现多态性，可以用于交配型的鉴定。Burgess等利用11个多态性sSR标记检测了40个代表不同形态型的Sphaeropsis sa pinea的分离物和与其密切相关的近缘种Botryos phaerisa obtuse的2个分离物，结果表明ssR标记能够清楚区分S.sapinea不同的形态型，并发现Ⅰ型分离物与B.obtuse相同，C型与A型的遗传关系比C型与B型的近，B型遗传多样性最丰富，其分离物能够根据不同的地理起源进一步被区分。Barnes等用ll对SSR引物分析了来自10个不同国家的20个C.fimbriata分离物，发现SSR标记可以明显地区分不同地理和不同寄主来源的专化性种群。对Phialo phora gregata的研究表明，SSR标记能够区分其种内的2个基因型。
3 展望
SSR标记虽然在植物病原菌中发展才刚刚起步，其应用也仅局限在少数植物病原菌，但已凸显出其强大的优越性。相对于其他标记，SSR标记共显性，多态性高，特别是具有分类学专化性等特点，是植物病原菌的种类鉴定、无毒基因鉴定与作图、起源与进化、传播与流行研究等最理想的分子标记。随着简单、有效和廉价的SSR标记分离技术不断发展，特别是植物病原菌基因组学的发展和大量DNA序列数据开发，SSR标记将会广泛应用在植物病原菌研究的各个方面。
关键词：植物病原菌；SSR标记；开发；利用
中图分类号：S 432．1
简单重复序列(simple sequence repeats，SSRs)又称微卫星(microsatellites)，是基因组序列中以1～6个核苷酸为基本重复单元的串联重复DNA序列，普遍存在于真核和原核生物基因组的编码区和非编码区。sSR分子标记具有高多态性、多等位性、共显性、分类学专化性、稳定性好、操作技术简单等特点，是十分有用的遗传标记，目前已广泛应用于动、植物遗传图谱构建、系统发育和遗传多样性研究、品种及基因型鉴定、目的基因及QTL的标记和标记辅助选择育种等研究。然而，常规的SSR标记开发一般是通过构建、筛选基因文库和测序等步骤完成，不但花费大，而且费工费时，因而限制了它在植物病原菌中的应用。近几年来一些新的SSR分离技术被发展，这些技术克服了传统SSR分离方法的缺点，简单有效，使植物病原菌SSR标记开发与应用成为可能。一些包括卵菌、真菌、线虫和细菌在内的植物病原菌SSR标记被陆续开发(表1)，并应用到研究的许多方面。
1 植物病原菌中SSR标记开发的主要策略
1．1 基于传统SSR标记开发技术
传统的SSR分子标记方法由Rassmann等发明。利用该方法开发SSR需要构建和筛选基因组文库，花费大量的人力、物力和财力，且效率较低，因此在植物病原菌中应用很少。迄今，仅有Lepto-sphaeria maculans、Sclerotinia sclerotiorum和Phytophthora in festans少量的SSR标记是通过该方法建立的。如Sirjusingh等通过构建S.sclero-tiorum基因组文库，用T4多核苷酸激酶和PrATP末端标记的含有(TC)10(TG)10、(TGTA)6TG、CT(ATCT)6、CT(CCT)5和(CAC)5CA寡核苷酸探针进行杂交筛选，阳性克隆用M13通用引物扩增，并测序插入片段，获得20多个SSR标记。
1．2 利用SSR富集文库筛选SSR标记
直接从基因组文库中筛选SSR位点效率较低。为了提高筛选效率，一些研究者建议通过构建SSR富集文库筛选SSR标记。富集SSR文库的构建方法主要有两种，一种是基于引物延伸的方法，一种是选择性杂交方法，这两种方法zane等已进行了详细综述。由于SSR筛选效率的显著提高，目前多数植物病原菌的SSR标记是通过构建SSR富集文库获得的。
基于引物延伸构建SSR富集文库的方法主要有两种。这两种方法首先都是将小基因组DNA片段插入到噬菌体质粒嵌合体或噬菌体载体构建单链DNA(ssDNA)初级文库，接着以ssDNA作为模板进行引物延伸反应，所用引物为特异重复寡核苷酸，只有含有目标重复序列的载体中产生双链DNA产物，但在恢复引物延伸产物程序上两种方法存在差异。用引物延伸的方法构建SSR富集文库开发SSR标记在动、植物中有一些应用，在植物病原菌中目前只有Chen等用该方法分离了几个Phialopho-ra gregata的SSR标记。
不同于引物延伸方法，选择性杂交构建SSR富集文库是将小基因组DNA片段连接到已知的DNA序列、载体或接头上，接着与固定在尼龙膜上的SSR探针或结合在链霉亲合素包被磁珠上的生物素标记SSR探针杂交，杂交后用洗液洗几次去除非特异性结合片段，再将DNA片段洗脱下来，PCR扩增恢复片段浓度，最后将DNA克隆到合适的载体上获得SSR富集文库。目前，绝大多数植物病原菌的SSR标记是通过该方法获得的。如Prospero等通过选择性杂交方法构建Phytophthora ramorum的(AC)13、(AG)13、(ACG)6、(ACC)8、(ACC)8和(AAT)12的SSR富集文库。用RsaI和BstUI限制酶消化基因组DNA，片段连接到superSNX后与3’端标记生物素并结合在磁珠上的寡核苷酸微卫星杂交，回收阳性片段，用SuperSNX24上游引物扩增，回收纯化片段再杂交，二次富集的PCR产物克隆到TOPOTA载体上，阳性重组克隆用M13的上下游引物扩增，500～1 000 bp的片段用M13的上游引物测序，搜索基元重复数多于6个的SSRs，用M13的下游引物反向测序，用经拼接好的序列设计引物，扩增14～30个P.ramorum菌株，获得多态性SSR标记。
1．3 基于ISSR-PCR的方法分离SSR
Zietkiewicz等发明了ISSR(简单序列重复间隔区)分子标记。用ISSR引物对全基因组DNA扩增，克隆测序后一般可以得到SSR序列一端的引物，即正向引物，采用染色体步行法进行第2次克隆测序设计引物，从而获得反向引物。ISSR-PCR分离SSR方法避免了文库的构建与筛选，有更强的目的性，大大缩短了时间，降低了研究费用，目前在植物病原菌中也有一定的应用。如Steimel等利用ISSR-PCR技术分离Cera-tocystis fimbiata中的SSR位点。他们用纯化的基因组DNA建立染色体步行文库，设计5’端锚定3～4个核苷酸的简并SSR引物DBV(CAT)8、DBH(CAG)8、BBH(AAG)8和BDB(GACA)。加接头引物AP1扩增文库，再将扩增产物连接T-载体克隆，提取重组质粒，限制酶酶切后电泳，筛选含有预期片段的质粒，测序阳性克隆，对合适的重复序列片段根据其3’侧翼序列设计两个反向步移引物进行扩增，得到上游片段，测序后再设计1个上游引物，扩增SSR片段，通过该方法共筛选出10个SSR位点。
1．4 利用FIASCO方法分离SSR标记
Zane于2002年提出了结合AFLP技术的SSR序列分离策略，即FIASCO法(利用AFLP快速分离重复序列)。该方法与选择性杂交相似，但步骤简单，成本低、效率高，步骤包括酶切基因组DNA，加上AFLP接头，特异性引物进行第1次PCR扩增，用生物素标记的探针与扩增产物杂交，经3次非 严谨性和3次严谨性洗脱去除非特异性杂交，变性分离DNA片段进行第2次扩增，PCR产物连接载体转化克隆测序。该方法在植物病原菌中也开始得到应用，如Hunter等用该方法开发Mycosphaerelanubilosa的SSR标记，其具体步骤为先用Mse I消化M.nubilosa基因组DNA，加AFLP接头进行PCR扩增，将扩增片段与(ATCC)5、(GATA)6、(AG)10(GT)17、(TC)15和(CA)15探针杂交，磁珠富集目的片段，连接T-载体，转化大肠杆菌，再扩增阳性菌落，选择100～500 bp的片段，纯化后直接测序以确定SSR的存在，试验共测定了126个克隆，其中15个含有SSR片段。Nakabonge等也用该方法分离了Cryphonectria eucalypti中的SSR标记。
1．5 利用DNA序列信息开发微卫星标记
虽然植物病原菌基因组研究起步较晚，但发展很快。目前，GenBank中已包含了数十种不同类型植物病原菌的EST序列或其他不同类型的DNA序列。除大量的植物病毒外，已有近40种植物病原细菌、15种植物病原菌真菌和3种疫霉菌全基因组测序已经完成或正在进行(http://cpgr.tigr.org)。一些原核生物全基因组序列中非冗余sSR数据库也已建立。因此，从DNA序列中特别是从EST中发掘SSR已经成为开发SSR标记快速、廉价、有效的途径。
最近，笔者对GenBank中28，197条Phytoph-thora sojae EST进行了SSR分析，在1 322条EST中发现1 408个SSR，选择243个SSR位点设计引物，用10个菌株基因组DNA进行PCR扩增，有193对引物(79.4％)能有效扩增，其中93对引物在10个大豆疫霉菌分离物间扩增出多态性。Feau等从Septoria musiva的117条非冗余EST序列中开发了5个多态性ssR标记。Lees等通过搜索EST和BAC序列寻找P.in festans的SSR标记，获得11个多态性SSR标记。
Grunwald等对两个测序完成的疫霉菌P.sojae(95 Mb)和P.ramorum(65 Mb)全基因组序列中2～6 bp重复的SSR进行了分析，在这两个菌的全基因组序列中分别发现了2 128个和1 000个SSRs。在P.ramorum全基因组序列中，Ivors等选出102个位点设计引物并用8个菌株进行检测，有62个(60.8％)能有效扩增，其中32个(51.6％)具有多态性；在P.sojae全基因组序列中，笔者选择了260个SSR位点设计引物，用4株P.sojae检测，发现有208对(80％)引物能有效扩增，115对(55.3％)在4个菌株之间显示多态性。
1．6 用亲缘关系相近物种的SSR标记
SSR侧翼序列具有保守性，有些物种的一些SSR引物能够在其近缘种、属中有效扩增。SSR标记在物种间的通用性取决于SSR侧翼序列的保守程度和SSR进化的稳定性。一些研究表明，基因组SSR标记的通用性一般较差，而EST-SSR标记的通用性较高。在植物病原菌中，一些种的SSR引物已证明能够在其近缘种中扩增(表1)。但为了获得一个新物种的专化性SSR标记，用近缘种SSR引物扩增获得的产物需要测序和重新设计引物。Lefrancois等用Armillaria ostoyae的SSR引物扩增A.gallica基因组DNA，克隆、测序扩增片段，获得6个含有SSR基元的片段，在这6个SSRs中，1个A.ostoyae引物直接用于A.gallica的扩增，其他5个需要重新设计引物以提高在A.ostoyae中的扩增效果。
此外，还有两种基于RAPD富集SSR的开发策略被发展，一种是将RAPD随机扩增条带与带有标记的微卫星探针杂交的RAHM(random amplifiedhybridization microsatellite)，一种利用重复锚定随机引物抑或将RAPD产物经克隆再用特异性的ssR探针及载体引物筛选阳性克隆的PIMA(PcRisolation of microsatellite arrays)，但这两种方法在植物病原菌中的应用目前没有报道。
2 SSR标记在植物病原菌中的应用
2．1 植物病原菌种群变异及进化研究
由于SSR标记为共显性，多态性高，特别是SSR位点具有分类学专化性，能够用于也许含有非目标微生物DNA的样品，因此，SSR是研究植物病原菌遗传变异与进化最理想的分子标记。
沈瑛等用7个SSR标记对Magnaporthegrisea的遗传多样性进行分析，获得了一些有用的信息。如对来自湖南烟溪稻瘟病病圃连续4年分离的105个稻瘟病菌分离物分析表明，同一病圃内稻瘟病菌存在丰富的遗传变异，但亲缘关系明确，105个分离物可划分为6个不同的系谱群，其中一一些系谱群在年度之间也存在遗传多样性；而对不同地理来源的稻瘟病菌分析表明，稻瘟病菌遗传多样性丰富而且亲缘关系复杂，研究的国外菌株具有与国内菌株相同的遗传背景和亲缘关系，国内菌株多样性不存在地理上的差异。Ivors等用SSR标记对P.ramorum的群体结构进行了深入分析，发现来自苗圃的病原菌遗传多样性显著高于森林中病原菌的遗传多样性，美国森林中只存在两个密切相关的基因型，而欧洲苗圃的病原菌群体遗传结构中等复杂，包括多个密切相关的基因型，多位点分析表明美国森林中的种群为无性繁殖，可能是某个单一引入个体的后代。Enjalbert等根据ssR标记和毒力分析结果将法国Puccinia striiformis f.sp.tritici种种群划分为南、北两个亚种群，其中北部种群属于西北欧种群，而南部种群最有可能与地中海种群相关，这两个亚种群来源于很早以前的两个分化的无性系谱。
此外，SSR标记也用于Dialodia pinea(=Sphaeropsis sapinea)、P.infestans、Sclerotin-ia sclerotiorum、Venturia inaequalis等植物病原菌的遗传多样性、遗传分化和进化研究。
2．2 遗传图谱的构建及无毒基因定位
目前，SSR标记已应用于M.grisea遗传图谱的构建和无毒基因定位。Kaye等首先将23个SSR标记整合到M.grisea的遗传图谱上，这些标记在M.grisea的7条染色体上都有分布，有的定位在缺少标记的区域。王艳丽等利用M.grisea菌株CH63和TH16杂交组合构建了包含100多个SSR 位点、覆盖7条染色体的遗传图谱并对6个无毒基因进行了初步定位。Kaye等将134个SSR标记填充到M.grisea的遗传图谱上，标记分布在6条染色体上，平均遗传距离为1 cm。最近，Ma等也利用ssR标记鉴定和精细作图了一个新的M.grisea无毒基因AvrPi15，SSR标记将该基因定位在M.grisea第6染色体上，在此基础上进一步获得了2个与该基因共分离的候选无毒基因标记，为该基因克隆奠定了基础。
2．3 用于病害流行学的研究
Gobbin等研究了Plasmopara viticola的二次侵染在霜霉病流行中的重要作用。用4个SSR标记分析了来自18个地方的4 685个病样，结果显示70％的基因型只出现1次，14％的基因型出现2次，只有7个基因型出现了50次以上，这说明P.viticola在流行中有许多基因类型，流行是多种基因型综合作用的结果，每一种在侵染中只有很小的作用，这种结论与前人结论向背，即孢子囊可以远距离传播，单种基因型造成流行。群体遗传学的研究可以为植物病害空间、时间的流行动态研究提供依据，分子标记又为遗传学的研究提供了便利的工具，特别是方便有效的分子标记。
2．4 用于病原菌鉴定及交配型、种内型的区分
SSR标记也是一种鉴定植物病原菌的种、菌株类型、菌株交配型、形态型及不同病原谱系的理想分子标记。Ivors等用12对SSR引物对分别来自美国和欧洲的大量P.ramorum、2株P.alateralis和2株P.hibernalis进行分析，发现只有1对引物在P.alateralis和P.hibernalis有扩增，且片段长度与P.ramorum中不同，认为SSR标记可用于P.ramorum的鉴定。Prospero等用P.ramorum基因组的ssR标记分析该菌两种交配型(A1、A2)，发现22个ssR位点中有7个在两个交配型中出现多态性，可以用于交配型的鉴定。Burgess等利用11个多态性sSR标记检测了40个代表不同形态型的Sphaeropsis sa pinea的分离物和与其密切相关的近缘种Botryos phaerisa obtuse的2个分离物，结果表明ssR标记能够清楚区分S.sapinea不同的形态型，并发现Ⅰ型分离物与B.obtuse相同，C型与A型的遗传关系比C型与B型的近，B型遗传多样性最丰富，其分离物能够根据不同的地理起源进一步被区分。Barnes等用ll对SSR引物分析了来自10个不同国家的20个C.fimbriata分离物，发现SSR标记可以明显地区分不同地理和不同寄主来源的专化性种群。对Phialo phora gregata的研究表明，SSR标记能够区分其种内的2个基因型。
3 展望
SSR标记虽然在植物病原菌中发展才刚刚起步，其应用也仅局限在少数植物病原菌，但已凸显出其强大的优越性。相对于其他标记，SSR标记共显性，多态性高，特别是具有分类学专化性等特点，是植物病原菌的种类鉴定、无毒基因鉴定与作图、起源与进化、传播与流行研究等最理想的分子标记。随着简单、有效和廉价的SSR标记分离技术不断发展，特别是植物病原菌基因组学的发展和大量DNA序列数据开发，SSR标记将会广泛应用在植物病原菌研究的各个方面。