建立了高效液相色谱-电喷雾串联质谱法直接测定蜂蜜中脯氨酸的方法。蜂蜜样品用去离子水溶解后,过0.45μm水相微孔滤膜,高效液相色谱-电喷雾串联质谱进行分析检测。以Phenomenex C18(100 mm×4.6mm×2.6μm)色谱柱为分析柱,乙腈和0.1%(v/v)甲酸-5 mmol/L乙酸铵水溶液为流动相进行梯度洗脱,在电喷雾正离子多反应监测模式下进行检测,外标法定量。通过加标验证,该方法检测低限可达25 mg/kg,脯氨酸在0.5～10.0μg/mL浓度范围内线性关系良好,相关系数大于0.99。在25、50和100 mg/kg三个加标水平下,蜂蜜中脯氨酸平均回收率为83.7～109.6%,相对标准偏差(RSD)为2.4～10.9%。该方法样品处理简单、快速,结果准确,灵敏度高,可以作为日常蜂蜜中脯氨酸的检测方法。