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摘 要 番木瓜环斑病毒（Papaya ringspot virus，PRSV）与番木瓜畸形花叶病毒（Papaya leaf distortion mosaic virus，PLDMV）存在混合感染的现象，近年来混合感染发病率逐年递增，是一种新的威胁番木瓜种植业的病毒病害。运用RT-PCR和RACE方法从混合感染样品中克隆获得2种病毒基因组全长cDNA，分别命名为PRSV-LM和PLDMV-LM，GenBank登录号分别为KT633943和KT633944，基因组序列大小分别为10 325、10 153 nt（不包括3′端的poly A）。序列分析表明：PRSV-LM与单独感染样品中的PRSV海南分离物HN（GenBank登录号：EF183499）的核苷酸序列和氨基酸序列相似性最高，为94%；PLDMV-LM与单独感染样品中的PLDMV海南分离物Hainan-DF（GenBank登录号：JX974555）核苷酸和氨基酸序列相似性最高，分别高达99%和97%。进化树分析显示，PRSV-LM和PLDMV-LM分别与单独感染样品的PRSV和PLDMV海南分离物有共同的进化起源。进一步利用实时荧光定量PCR对混合感染样品的PRSV与PLDMV病毒积累量进行分析，结果表明，混合感染样品中PLDMV病毒积累量大约是PRSV含量的100倍。研究结果为进一步探究PRSV/PLDMV混合感染发病机制奠定基础。
关键词 混合感染；PRSV；PLDMV；序列分析；绝对定量
中图分类号 S436.67 文献标识码 A
番木瓜环斑病毒（Papaya ringspot virus，PRSV）与番木瓜畸形花叶病毒（Papaya leaf distortion mosaic virus，PLDMV）同属于马铃薯Y病毒科马铃薯Y病毒属病毒，都以番木瓜科和葫芦科植物为主要寄主。在自然界中，主要以棉蚜和桃蚜为媒介以非持久性方式传播[1-2]，也可通过机械损伤（摩擦接种等）方式进行接种，并且2种病毒在番木瓜上引起的病症极为相似，在田间难以通过症状表现进行鉴别[3]。由于PRSV/PLDMV混合感染表现在番木瓜上的病症与单独感染样品上的病症无明显区别，近几年在海南岛混合感染的发病率逐年递增，已成为一种新的威胁番木瓜种植业的病毒病害。
2008年，中国台湾地区发现PRSV/PLDMV和PRSV/PapMV混合感染的现象[4]，2009年，菲律宾也在番木瓜种植区检测到PRSV/PLDMV和PRSV/PapMV混合感染的植株[5]，最近几年本研究组对海南岛番木瓜病毒病的调查，发现也存在PRSV和PLDMV混合感染番木瓜的现象，且混合感染样品的检出率从2012年的3.3%，递增到2013年底至2014年初的17.3%[6-7]。尽管已有研究人员通过人工混合接种马铃薯Y病毒属李痘病毒（Plum pox virus，PPV）和烟草脉斑驳病毒（Tobacco vein mottling virus，TVMV）发现，两者之间存在共同排斥作用[8]，但是具体的机制并不清楚，且PPV和TVMV的自然寄主和病症存在差异，而PRSV与PLDMV有着非常类似的生态背景并在番木瓜上产生类似的病症，它们混合感染的发病生态和机制方面至今尚未见报道。鉴于以上情况，本研究拟从混合感染的样品中分离PRSV与PLDMV，测序获得2种病毒的全基因组序列，并与已知单独感染的样品序列进行比对分析，同时对混合感染中的病毒积累量进行荧光定量PCR检测，所得到的研究结果为深入研究混合感染样品中PRSV/PLDMV的互作及其感染机制奠定基础，也为制定正确的防病抗病策略提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料 本实验所用的PRSV与PLDMV混合感染番木瓜病叶，于2012年采自海南省陵水县光坡镇，长期保存于-80 ℃冰箱。
1.1.2 菌株 大肠杆菌Trans5α、Trans10购自北京全式金生物技术有限公司。
1.1.3 主要试剂 Trizol购自Ambion公司；反转录试剂PrimeScriptTM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit与RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0、高保真酶Prime STAR HS（Premix）、载体pMD18-T Vector、Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）、SYBRR Premix Ex TaqTM II购自大连TaKaRa公司；pGEM-T Easy载体购自Promega公司；PhusionR Hot Start Flex 2X Master Mix购自NEB公司；E.Z.N.A. Plasmid Mini KitⅠ、E.Z.N.A. Gel Extraction Kit购自OMEGA公司。
1.2 方法
1.2.1 引物设计与合成 根据GenBank中已登录的PRSV（登录号：AB369277，AY010722，AY027810，AY162218，AY231130，DQ340769，DQ340770，DQ340771，EF017707，EF183499，EU126128，EU882728，HQ424465，JX448369，JX448370，JX448372，JX448373，KF734962，kf791028，KJ755852，X97251）与PLDMV（登录号：AB088221，EU233272，JX416282，JX974555）基因组序列全长，利用Vector NTI advance 11软件分别设计引物（见表1），用于扩增2种病毒全长基因组cDNA序列。引物均由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。
1.2.2 病叶总RNA提取及cDNA合成 从-80 ℃取混合感染的番木瓜感病叶片，称取约100 mg，液氮研磨后，利用Trizol法提取番木瓜叶片总RNA。以总RNA为模板，使用 RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0试剂盒，合成cDNA第一链。具体方法参照产品说明书进行。 1.2.3 PRSV与PLDMV序列的分段克隆 以cDNA为模板，分别使用4对含重叠区域的特异引物（PRSV引物对： prsv5z/prsv1991f，prsv1803z/prsv5141f，prsv4890z/prsv7581f，prsv7448z/prsv3f； PLDMV引物对：pldmv5z/pldmv3137f，pldmv2935z/pldmv5069f，pldmv4858z/pldmv8165f，pldmv7954z/pldmv3f，见表1），对PRSV与PLDMV全长基因组进行分段克隆（图1）。PCR反应体系为50 μL：Primer STAR HS （Premix）25 μL，上、下游引物（20 μm）各1 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O 21 μL。反应条件：98 ℃预变性10 s；98 ℃变性10 s，47 ℃～53 ℃退火15 s，72 ℃延伸3 min，30个循环；72 ℃终延伸10 min。PCR扩增产物进行普通琼脂糖凝胶电泳检测，并回收相应的目标DNA片段，回收片段经加A处理后与T载体（pMD18-T Vector或pGEM-T Easy）进行连接，然后转化大肠杆菌感受态细胞trans 10（或trans5α），涂布于含有Amp、X-gal和IPTG的LB固体培养基平板上，37 ℃过夜培养，待长出单菌落后挑取单克隆，进行菌液PCR鉴定，筛选出阳性克隆，选取3～5个送公司进行序列测定。
1.2.4 3′-RACE 使用Takara RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0试剂盒进行PRSV与PLDMV的3′-RACE实验。以试剂盒提供的Oligo dT-Adaptor Primer为引物，反转录合成cDNA第一链。根据上述已测定的克隆序列，分别设计PRSV与PLDMV 3′端的基因特异引物，再以合成的cDNA第一链为模板，分别用引物对prsv9720z/M13 Primer M4、pldmvC1F/ M13 Primer M4（见表1）进行PCR扩增。反应体系及条件参照产品说明书。对获得的目的片段进行回收和T/A克隆，最后进行序列测定和分析。
1.2.5 生物信息学分析 利用NCBI Blastn对测序结果在线比对分析，然后通过Vector NTI Advance 11软件（Invitrogen，美国）进行拼接、比对分析，再用Clustal X 2.1软件进行核苷酸和氨基酸序列的多序列比对，将比对结果利用MEGA5.1软件的邻近法分别构建PRSV与PLDMV各分离物的核苷酸和氨基酸序列进化树[9]，最后根据系统发育进化树分析病毒起源。
1.2.6 荧光实时定量PCR检测 （1）荧光定量 PCR反应体系及条件。荧光定量实验采用SYBRR Premix Ex TaqTM II试剂盒，反应体系为20 μL：SYBR Premix Ex TaqⅡ（2×）10 μL，Forward Primer（20 μm）0.4 μL，Reverse Primer（20 μm）0.4 μL，ROX Reference Dye（50×）0.4 μL，模板2 μL，ddH2O 6.8 μL。设置荧光实时定量PCR仪反应参数为：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，36cycle；95 ℃ 1 min，55 ℃ 30 s，95 ℃ 30 s。
（2）绝对定量检测。本研究采用绝对定量，首先制备标准曲线。以含有PRSV CI基因和PLDMV CP基因的质粒为模板，分别以引物对PRSV-bF/PRSV-bR（见表1）扩增长约136 bp的PRSV目的检测片段，以PLDMV-CP1F/PLDMV-CP1R（见表1）扩增长约128 bp的PLDMV目的检测片段。以实验室保存的质粒为模板，利用高保真酶PrimeSTAR HS （Premix）进行PCR扩增，然后回收扩增所得目的片段，进行T/A克隆，得到质粒PRSV-b、PLDMV-CP1。使用NanoVueTM ultraviolet spectrophotometer 测定质粒PRSV-b与PLDMV-CP1的浓度，使用下列公式计算拷贝数，-20 ℃保存备用。
质粒拷贝数/μL=6.02×1023×质粒浓度×10-9/DNA×660[10]。
用ddH2O稀释质粒使拷贝数为1×109，在此基础上以10倍梯度进行稀释，并将一系列梯度稀释质粒作为模板，建立标准曲线。将混合感染PRSV/PLDMV的样品编号，进行实时定量PCR检测，每个样品设置2个重复（复孔），设置2次重复实验，计算Ct平均值，然后根据所测样品的Ct平均值计算样品中病毒的拷贝数，完成定量。
2 结果与分析
2.1 PRSV与PLDMV全长基因组序列测定及分析
将获得的PRSV和PLDMV基因组各cDNA片段分别进行拼接，得到这2种病毒全基因组序列，其全长分别为10 325 bp和10 153 bp，将2种病毒序列提交GenBank，分别命名为PRSV-LM和PLDMV-LM，登录号分别为KT633943和KT633944。经NCBI Blastn比对，PRSV-LM与GenBank所收录的其他PRSV全长核苷酸序列相似性为82%～94%，氨基酸序列相似性为89%～94%，与其中HN（登录号EF183499）的核苷酸和氨基酸序列相似性均为94%；PLDMV-LM与GenBank所收录的其他PLDMV全长核苷酸序列相似性达到94%～99%，氨基酸序列相似性为93%～97%，其中，与HaiNan-DF（登录号：JX974555）核苷酸和氨基酸序列相似性分别为99%和97%（图2）。
2.2 系统发育树分析
2.2.1 PRSV系统发育树分析 通过Clustal X2.1和MEGA 5.1软件分析，建树序列多重比对后的序列长度为10 317 bp，NJ法构建PRSV-LM与其它23个PRSV病毒的系统发育树见图2所示，核苷酸进化树显示PRSV-LM与HN（EF183499）、Hainan-HN（KF734962）、PRSV-HNVb（KF791028）、HN-1（HQ424465）进化紧密相关，形成一个小进化簇，结合氨基酸进化树分析，PRSV-LM在分子水平上与Hainan-DF、Hainan-HN最为接近。由此可见，PRSV-LM在系统发育关系上与海南地区的4个已知PRSV分离物有共同起源。 2.2.2 PLDMV系统发育树分析 通过Clustal X2.1和MEGA 5.1软件分析，建树序列多重比对后的序列长度为10 261 bp，NJ法重建系统发育树见图2所示，核苷酸和氨基酸进化树显示PLDMV-LM首先与Hainan-DF（JX974555）聚为一簇，后与Japan-J56P（AB088221）进一步相聚成一个小进化簇。由此，PLDMV-LM分子水平上与Hainan-DF最为接近，且系统发育关系上与Japan-J56P有共同起源。
2.3 实时定量PCR检测分析
2.3.1 对混合感染样品中2种病毒进行绝对定量检测 PRSV标准品建立标准曲线的5个稀释浓度分别为7.18×103、7.18×104、7.18×105、7.18×106、7.18×107 copies，阈值0.283，相关系数R2=0.994，扩增效率Eff=104.4%，建立的标准曲线Y=-3.221×log（X）+39.96；PLDMV标准品建立标准曲线的5个稀释浓度分别为9.64×103、9.64×104、9.64×105、9.64×106、9.64×107 copies，阈值为0.283，R2=0.997，Eff=105.4%，Y=-3.198×log（X）+39.67。（其中X为模板拷贝数，Y为样品循环数）
2.3.2 PRSV与PLDMV初始拷贝数计算 从图3可以看出，标准品与样品扩增曲线均形成“S型”良好扩增，样品溶解曲线无杂峰，说明没有引物二聚体等非特异扩增发生，数据可靠[11-13]。从图3-e， g可以看出，PLDMV-LM明显比PRSV-LM起峰要早，由此可见PLDMV-LM含量要比PRSV-LM含量要高。
2次重复测定，得到混合感染样品中各自PRSV和PLDMV的Ct平均值， 并计算得标准差及Ct值变异系数（见表2）。其中，Ct值的变异系数除PLDMV2为6.54%外，其余变异系数均小于5%，在误差允许范围内。说明建立的荧光定量PCR检测方法对样品检测结果均有较好重复性。
通过2.3.1中公式计算出PRSV-LM与PLDMV-LM的具体拷贝数，结果见表3所示。从表3可以看出，同一混合感染样品中PLDMV拷贝数大约是PRSV的100倍，可见，在混合感染番木瓜植株中PLDMV比PRSV占优势，然而2种病毒之间是协生还是拮抗作用，还有待进一步研究。
3 讨论
许多重要的病毒病害是多种病毒相互作用共同侵染引起的，植物病毒的混合感染在自然界中是普遍存在的现象[14]。关于PRSV/PLDM病毒混合感染番木瓜的现象，在已有的研究报道中，仅存在相关检测和发现的报道，而PRSV与PLDMV同属马铃薯Y病毒属病毒，结合先前对马铃薯Y病毒属病毒混合感染的研究报道进行讨论分析。目前关于马铃薯Y病毒属病毒混合感染的研究发现，病毒之间存在协生和拮抗方式感染同一寄主。关于马铃薯Y病毒属病毒参与的协生作用，己有相关报道，包括烟草脉斑驳病毒（Tobacco vein mottling virus，TVMV）、马铃薯Y病毒（Potato virus Y，PVY）或者烟草蚀纹病毒病（Tobacco etch virus，TEV）与马铃薯X病毒（Potato virus X，PVX）的协生，芜菁花叶病毒（Turnip mosaic virus，TuMV）与黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）的协生作用[14-16]，PVY和烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus， TMV）共同侵染马铃薯野生种时的协生作用[17]，甘薯羽状斑驳病毒（Sweet potato feathery mottle virus，SPFMV，genus Potyvirus）和甘薯褪绿矮化病毒（Sweet potato chlorotic stunt virus，SPCSV，genus Crinivirus）复合侵染甘薯时的协生作用[18]。对于马铃薯Y病毒属病毒间混合感染存在共同排斥作用，例如Dietrich等将PPV、TVMV和三叶草黄脉病毒（Clover yellow vein virus，CIYVV）分别改造嵌入荧光蛋白观察混合感染后病毒在植株体内的分布情况[8]。这些实验为后续研究PRSV与PLDMV混合感染番木瓜中的发病生态和机制提供了重要的参考。
为了对PRSV/PLDMV病毒混合感染的现象进行初步研究，本次实验将得到2种病毒的全基因组序列，经一系列比对分析，发现混合感染的PRSV-LM和PLDMV-LM均与实验室已得到的单独感染的PRSV和PLDMV海南分离物具有相同的进化起源，尤其是近几年在海南地区发现的PLDMV，其核苷酸和氨基酸序列与Hainan-DF相似度极高，PLDMV-LM极有可能是由Hainan-DF的核苷酸序列碱基突变所致。
本研究还通过对原始混合感染的PRSV/PLDMV进行荧光实时PCR定量检测，发现混合感染的番木瓜植株中PLDMV要比PRSV占优势，而本次实验只是针对原始病叶进行检测，是否具有普遍性还有待进一步实验。为深入了解PRSV/PLDMV混合感染病毒之间的作用，后续实验构建来自混合感染PRSV和PLDMV样品中的PRSV-M/PLDMV-M分离物侵染性克隆，于网室人工单接种和混合接种PRSV-LM/PLDMV-LM，获得单感染和混合感染PRSV-LM/PLDMV-LM的植株，结合PRSV-LM/PLDMV-LM在单感染和混合感染寄主后的病症差异和病毒积累量，研究2种病毒之间的交互作用情况。而且混合感染的PRSV/PLDMV病毒间的相互作用，可能导致新的遗传特性的产生，从而改变病毒种群的遗传结构。因此，深入探究并阐明PRSV/PLDMV混合感染的机制对了解病毒的发病机理和演化，以及相应的抗病策略制定至关重要。
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关键词 混合感染；PRSV；PLDMV；序列分析；绝对定量
中图分类号 S436.67 文献标识码 A
番木瓜环斑病毒（Papaya ringspot virus，PRSV）与番木瓜畸形花叶病毒（Papaya leaf distortion mosaic virus，PLDMV）同属于马铃薯Y病毒科马铃薯Y病毒属病毒，都以番木瓜科和葫芦科植物为主要寄主。在自然界中，主要以棉蚜和桃蚜为媒介以非持久性方式传播[1-2]，也可通过机械损伤（摩擦接种等）方式进行接种，并且2种病毒在番木瓜上引起的病症极为相似，在田间难以通过症状表现进行鉴别[3]。由于PRSV/PLDMV混合感染表现在番木瓜上的病症与单独感染样品上的病症无明显区别，近几年在海南岛混合感染的发病率逐年递增，已成为一种新的威胁番木瓜种植业的病毒病害。
2008年，中国台湾地区发现PRSV/PLDMV和PRSV/PapMV混合感染的现象[4]，2009年，菲律宾也在番木瓜种植区检测到PRSV/PLDMV和PRSV/PapMV混合感染的植株[5]，最近几年本研究组对海南岛番木瓜病毒病的调查，发现也存在PRSV和PLDMV混合感染番木瓜的现象，且混合感染样品的检出率从2012年的3.3%，递增到2013年底至2014年初的17.3%[6-7]。尽管已有研究人员通过人工混合接种马铃薯Y病毒属李痘病毒（Plum pox virus，PPV）和烟草脉斑驳病毒（Tobacco vein mottling virus，TVMV）发现，两者之间存在共同排斥作用[8]，但是具体的机制并不清楚，且PPV和TVMV的自然寄主和病症存在差异，而PRSV与PLDMV有着非常类似的生态背景并在番木瓜上产生类似的病症，它们混合感染的发病生态和机制方面至今尚未见报道。鉴于以上情况，本研究拟从混合感染的样品中分离PRSV与PLDMV，测序获得2种病毒的全基因组序列，并与已知单独感染的样品序列进行比对分析，同时对混合感染中的病毒积累量进行荧光定量PCR检测，所得到的研究结果为深入研究混合感染样品中PRSV/PLDMV的互作及其感染机制奠定基础，也为制定正确的防病抗病策略提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料 本实验所用的PRSV与PLDMV混合感染番木瓜病叶，于2012年采自海南省陵水县光坡镇，长期保存于-80 ℃冰箱。
1.1.2 菌株 大肠杆菌Trans5α、Trans10购自北京全式金生物技术有限公司。
1.1.3 主要试剂 Trizol购自Ambion公司；反转录试剂PrimeScriptTM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit与RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0、高保真酶Prime STAR HS（Premix）、载体pMD18-T Vector、Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）、SYBRR Premix Ex TaqTM II购自大连TaKaRa公司；pGEM-T Easy载体购自Promega公司；PhusionR Hot Start Flex 2X Master Mix购自NEB公司；E.Z.N.A. Plasmid Mini KitⅠ、E.Z.N.A. Gel Extraction Kit购自OMEGA公司。
1.2 方法
1.2.1 引物设计与合成 根据GenBank中已登录的PRSV（登录号：AB369277，AY010722，AY027810，AY162218，AY231130，DQ340769，DQ340770，DQ340771，EF017707，EF183499，EU126128，EU882728，HQ424465，JX448369，JX448370，JX448372，JX448373，KF734962，kf791028，KJ755852，X97251）与PLDMV（登录号：AB088221，EU233272，JX416282，JX974555）基因组序列全长，利用Vector NTI advance 11软件分别设计引物（见表1），用于扩增2种病毒全长基因组cDNA序列。引物均由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。
1.2.2 病叶总RNA提取及cDNA合成 从-80 ℃取混合感染的番木瓜感病叶片，称取约100 mg，液氮研磨后，利用Trizol法提取番木瓜叶片总RNA。以总RNA为模板，使用 RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0试剂盒，合成cDNA第一链。具体方法参照产品说明书进行。 1.2.3 PRSV与PLDMV序列的分段克隆 以cDNA为模板，分别使用4对含重叠区域的特异引物（PRSV引物对： prsv5z/prsv1991f，prsv1803z/prsv5141f，prsv4890z/prsv7581f，prsv7448z/prsv3f； PLDMV引物对：pldmv5z/pldmv3137f，pldmv2935z/pldmv5069f，pldmv4858z/pldmv8165f，pldmv7954z/pldmv3f，见表1），对PRSV与PLDMV全长基因组进行分段克隆（图1）。PCR反应体系为50 μL：Primer STAR HS （Premix）25 μL，上、下游引物（20 μm）各1 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O 21 μL。反应条件：98 ℃预变性10 s；98 ℃变性10 s，47 ℃～53 ℃退火15 s，72 ℃延伸3 min，30个循环；72 ℃终延伸10 min。PCR扩增产物进行普通琼脂糖凝胶电泳检测，并回收相应的目标DNA片段，回收片段经加A处理后与T载体（pMD18-T Vector或pGEM-T Easy）进行连接，然后转化大肠杆菌感受态细胞trans 10（或trans5α），涂布于含有Amp、X-gal和IPTG的LB固体培养基平板上，37 ℃过夜培养，待长出单菌落后挑取单克隆，进行菌液PCR鉴定，筛选出阳性克隆，选取3～5个送公司进行序列测定。
1.2.4 3′-RACE 使用Takara RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0试剂盒进行PRSV与PLDMV的3′-RACE实验。以试剂盒提供的Oligo dT-Adaptor Primer为引物，反转录合成cDNA第一链。根据上述已测定的克隆序列，分别设计PRSV与PLDMV 3′端的基因特异引物，再以合成的cDNA第一链为模板，分别用引物对prsv9720z/M13 Primer M4、pldmvC1F/ M13 Primer M4（见表1）进行PCR扩增。反应体系及条件参照产品说明书。对获得的目的片段进行回收和T/A克隆，最后进行序列测定和分析。
1.2.5 生物信息学分析 利用NCBI Blastn对测序结果在线比对分析，然后通过Vector NTI Advance 11软件（Invitrogen，美国）进行拼接、比对分析，再用Clustal X 2.1软件进行核苷酸和氨基酸序列的多序列比对，将比对结果利用MEGA5.1软件的邻近法分别构建PRSV与PLDMV各分离物的核苷酸和氨基酸序列进化树[9]，最后根据系统发育进化树分析病毒起源。
1.2.6 荧光实时定量PCR检测 （1）荧光定量 PCR反应体系及条件。荧光定量实验采用SYBRR Premix Ex TaqTM II试剂盒，反应体系为20 μL：SYBR Premix Ex TaqⅡ（2×）10 μL，Forward Primer（20 μm）0.4 μL，Reverse Primer（20 μm）0.4 μL，ROX Reference Dye（50×）0.4 μL，模板2 μL，ddH2O 6.8 μL。设置荧光实时定量PCR仪反应参数为：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，36cycle；95 ℃ 1 min，55 ℃ 30 s，95 ℃ 30 s。
（2）绝对定量检测。本研究采用绝对定量，首先制备标准曲线。以含有PRSV CI基因和PLDMV CP基因的质粒为模板，分别以引物对PRSV-bF/PRSV-bR（见表1）扩增长约136 bp的PRSV目的检测片段，以PLDMV-CP1F/PLDMV-CP1R（见表1）扩增长约128 bp的PLDMV目的检测片段。以实验室保存的质粒为模板，利用高保真酶PrimeSTAR HS （Premix）进行PCR扩增，然后回收扩增所得目的片段，进行T/A克隆，得到质粒PRSV-b、PLDMV-CP1。使用NanoVueTM ultraviolet spectrophotometer 测定质粒PRSV-b与PLDMV-CP1的浓度，使用下列公式计算拷贝数，-20 ℃保存备用。
质粒拷贝数/μL=6.02×1023×质粒浓度×10-9/DNA×660[10]。
用ddH2O稀释质粒使拷贝数为1×109，在此基础上以10倍梯度进行稀释，并将一系列梯度稀释质粒作为模板，建立标准曲线。将混合感染PRSV/PLDMV的样品编号，进行实时定量PCR检测，每个样品设置2个重复（复孔），设置2次重复实验，计算Ct平均值，然后根据所测样品的Ct平均值计算样品中病毒的拷贝数，完成定量。
2 结果与分析
2.1 PRSV与PLDMV全长基因组序列测定及分析
将获得的PRSV和PLDMV基因组各cDNA片段分别进行拼接，得到这2种病毒全基因组序列，其全长分别为10 325 bp和10 153 bp，将2种病毒序列提交GenBank，分别命名为PRSV-LM和PLDMV-LM，登录号分别为KT633943和KT633944。经NCBI Blastn比对，PRSV-LM与GenBank所收录的其他PRSV全长核苷酸序列相似性为82%～94%，氨基酸序列相似性为89%～94%，与其中HN（登录号EF183499）的核苷酸和氨基酸序列相似性均为94%；PLDMV-LM与GenBank所收录的其他PLDMV全长核苷酸序列相似性达到94%～99%，氨基酸序列相似性为93%～97%，其中，与HaiNan-DF（登录号：JX974555）核苷酸和氨基酸序列相似性分别为99%和97%（图2）。
2.2 系统发育树分析
2.2.1 PRSV系统发育树分析 通过Clustal X2.1和MEGA 5.1软件分析，建树序列多重比对后的序列长度为10 317 bp，NJ法构建PRSV-LM与其它23个PRSV病毒的系统发育树见图2所示，核苷酸进化树显示PRSV-LM与HN（EF183499）、Hainan-HN（KF734962）、PRSV-HNVb（KF791028）、HN-1（HQ424465）进化紧密相关，形成一个小进化簇，结合氨基酸进化树分析，PRSV-LM在分子水平上与Hainan-DF、Hainan-HN最为接近。由此可见，PRSV-LM在系统发育关系上与海南地区的4个已知PRSV分离物有共同起源。 2.2.2 PLDMV系统发育树分析 通过Clustal X2.1和MEGA 5.1软件分析，建树序列多重比对后的序列长度为10 261 bp，NJ法重建系统发育树见图2所示，核苷酸和氨基酸进化树显示PLDMV-LM首先与Hainan-DF（JX974555）聚为一簇，后与Japan-J56P（AB088221）进一步相聚成一个小进化簇。由此，PLDMV-LM分子水平上与Hainan-DF最为接近，且系统发育关系上与Japan-J56P有共同起源。
2.3 实时定量PCR检测分析
2.3.1 对混合感染样品中2种病毒进行绝对定量检测 PRSV标准品建立标准曲线的5个稀释浓度分别为7.18×103、7.18×104、7.18×105、7.18×106、7.18×107 copies，阈值0.283，相关系数R2=0.994，扩增效率Eff=104.4%，建立的标准曲线Y=-3.221×log（X）+39.96；PLDMV标准品建立标准曲线的5个稀释浓度分别为9.64×103、9.64×104、9.64×105、9.64×106、9.64×107 copies，阈值为0.283，R2=0.997，Eff=105.4%，Y=-3.198×log（X）+39.67。（其中X为模板拷贝数，Y为样品循环数）
2.3.2 PRSV与PLDMV初始拷贝数计算 从图3可以看出，标准品与样品扩增曲线均形成“S型”良好扩增，样品溶解曲线无杂峰，说明没有引物二聚体等非特异扩增发生，数据可靠[11-13]。从图3-e， g可以看出，PLDMV-LM明显比PRSV-LM起峰要早，由此可见PLDMV-LM含量要比PRSV-LM含量要高。
2次重复测定，得到混合感染样品中各自PRSV和PLDMV的Ct平均值， 并计算得标准差及Ct值变异系数（见表2）。其中，Ct值的变异系数除PLDMV2为6.54%外，其余变异系数均小于5%，在误差允许范围内。说明建立的荧光定量PCR检测方法对样品检测结果均有较好重复性。
通过2.3.1中公式计算出PRSV-LM与PLDMV-LM的具体拷贝数，结果见表3所示。从表3可以看出，同一混合感染样品中PLDMV拷贝数大约是PRSV的100倍，可见，在混合感染番木瓜植株中PLDMV比PRSV占优势，然而2种病毒之间是协生还是拮抗作用，还有待进一步研究。
3 讨论
许多重要的病毒病害是多种病毒相互作用共同侵染引起的，植物病毒的混合感染在自然界中是普遍存在的现象[14]。关于PRSV/PLDM病毒混合感染番木瓜的现象，在已有的研究报道中，仅存在相关检测和发现的报道，而PRSV与PLDMV同属马铃薯Y病毒属病毒，结合先前对马铃薯Y病毒属病毒混合感染的研究报道进行讨论分析。目前关于马铃薯Y病毒属病毒混合感染的研究发现，病毒之间存在协生和拮抗方式感染同一寄主。关于马铃薯Y病毒属病毒参与的协生作用，己有相关报道，包括烟草脉斑驳病毒（Tobacco vein mottling virus，TVMV）、马铃薯Y病毒（Potato virus Y，PVY）或者烟草蚀纹病毒病（Tobacco etch virus，TEV）与马铃薯X病毒（Potato virus X，PVX）的协生，芜菁花叶病毒（Turnip mosaic virus，TuMV）与黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）的协生作用[14-16]，PVY和烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus， TMV）共同侵染马铃薯野生种时的协生作用[17]，甘薯羽状斑驳病毒（Sweet potato feathery mottle virus，SPFMV，genus Potyvirus）和甘薯褪绿矮化病毒（Sweet potato chlorotic stunt virus，SPCSV，genus Crinivirus）复合侵染甘薯时的协生作用[18]。对于马铃薯Y病毒属病毒间混合感染存在共同排斥作用，例如Dietrich等将PPV、TVMV和三叶草黄脉病毒（Clover yellow vein virus，CIYVV）分别改造嵌入荧光蛋白观察混合感染后病毒在植株体内的分布情况[8]。这些实验为后续研究PRSV与PLDMV混合感染番木瓜中的发病生态和机制提供了重要的参考。
为了对PRSV/PLDMV病毒混合感染的现象进行初步研究，本次实验将得到2种病毒的全基因组序列，经一系列比对分析，发现混合感染的PRSV-LM和PLDMV-LM均与实验室已得到的单独感染的PRSV和PLDMV海南分离物具有相同的进化起源，尤其是近几年在海南地区发现的PLDMV，其核苷酸和氨基酸序列与Hainan-DF相似度极高，PLDMV-LM极有可能是由Hainan-DF的核苷酸序列碱基突变所致。
本研究还通过对原始混合感染的PRSV/PLDMV进行荧光实时PCR定量检测，发现混合感染的番木瓜植株中PLDMV要比PRSV占优势，而本次实验只是针对原始病叶进行检测，是否具有普遍性还有待进一步实验。为深入了解PRSV/PLDMV混合感染病毒之间的作用，后续实验构建来自混合感染PRSV和PLDMV样品中的PRSV-M/PLDMV-M分离物侵染性克隆，于网室人工单接种和混合接种PRSV-LM/PLDMV-LM，获得单感染和混合感染PRSV-LM/PLDMV-LM的植株，结合PRSV-LM/PLDMV-LM在单感染和混合感染寄主后的病症差异和病毒积累量，研究2种病毒之间的交互作用情况。而且混合感染的PRSV/PLDMV病毒间的相互作用，可能导致新的遗传特性的产生，从而改变病毒种群的遗传结构。因此，深入探究并阐明PRSV/PLDMV混合感染的机制对了解病毒的发病机理和演化，以及相应的抗病策略制定至关重要。
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