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【摘 要】 本研究人工设计合成了具有SOD和GPx氨基酸一级序列的小肽，将目的蛋白中活性部位的化学修饰位点设计成Cys，同时将其它位点的Cys变成不影响结构的其他氨基酸获得人工合成的76个氨基酸的抗氧化肽序列，尝试利用E.coli的营养缺陷型表达系统进行76肽模拟物的表达，并对表达的肽活性进行鉴定，预期为抗氧化模拟物的研究提供一些理论参数。
【关键词】 双酶蛋白制备；蛋白表达；活性分析
[Abstract] In this study the artificial design was synthesized with SOD and GPx amino acid sequence of small peptide， the active site of target protein modification sites designed Cys， at the same time will not affect the structure of other sites of Cys become available from other amino acids 76 synthetic antioxidant peptide sequence of amino acids， and try to take advantage of e.c. with our fabrication： oli auxotroph expression system for the expression of 76 peptide analogues， and the expression of peptide activity appraisal， expectations for oxidation of simulation study provides some theoretical parameters.
[Key words] double enzyme protein preparation； protein expression； activity analysis
天然抗氧化酶稳定性差、来源受限且分子量较大等缺点一直限制其在各个领域的实际应用。由于抗氧化酶对维持正常生命活动的重要性，使得科学家们一直在利用模拟手段去设计并改造天然抗氧化酶，以便阐明酶催化反应机理和提高其实际应用价值。但机体内的抗氧化酶是通过协同作用来维持该系统平衡的，且进程也复杂多变，因此，对于单一功能酶的研究和模拟显然不能深入理解这个复杂的抗氧化酶系统，开展具有抗氧化能力的多功能酶的模拟势在必行[1]。
在此之前，我们利用近几年的时间对具有SOD和GPx活力的模拟酶进行了一部分研究，以SOD和GPx序列为基础，基于模块酶的设计理念，我们构建了一个具有谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶雙酶活性的含硒65肽，但由于其分子量较大，很难进入细胞内发挥作用。故此，我们在此65肽的氨基端连接上人免疫缺陷病毒反式转录激活因子的蛋白穿膜结构域的氨基酸序列，即细胞穿膜肽，使其具有穿透生物膜的能力，获得76肽模拟物，并在大肠杆菌中成功融合表达，再通过硒化，得到了具有SOD和GPx活力的模拟酶。
1 材料
1.1 试验材料
65P肽（HQHQFGDLSQGAESTGPHYNPLAVPHPQHPGDWGNFAVRDGSLWPFLRHVYGRPRACVV HAGED）由本实验室保留，大肠杆菌克隆菌株E. coli pET22b由本实验室保留。
1.2 主要试剂
核酸染料（SYBR?GreenⅠ）、核酸分子量标准（DL2000，DL15000 DNA Marker）购于TAKALA公司，T4 DNA连接酶购自MBI公司，胰蛋白胨、酵母粉、琼脂购于Oxiod公司；琼脂糖购于Promega 公司；异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside， IPTG）、氨苄青霉素（ampicillin， Amp）、卡那霉素（kanamycin， Kana）购于上海生工生物技术有限公司；小型质粒抽提试剂盒购于北京天根生化科技有限公司；限制性内切酶Xba I和Nde I购于大连宝生物公司；蛋白质Marker购于Solabio有限公司；DNA Marker 购于宝生物大连生物工程公司；四甲基二乙胺（TEMED）、考马斯亮蓝R-250、十二烷基磺酸钠、丙烯酰胺、过硫酸铵（APS）、甘氨酸、溴酚蓝（BPB）、Tris、甘油、醋酸、乙醇等其他生化试剂和常规试剂均为分析纯。
2 方法
2.1 76肽的构建与鉴定
在原有65P肽氨基酸序列的基础上，连接TAT穿膜肽（YGRKKRRQRRR）使其能穿透细胞膜并在细胞内发挥生物学效应[2]，对其蛋白质三维空间结构进行预测，构建76肽的初始三维结构。借助生物信息学软件Primer Premier 5.0的辅助下，合成含有SOD和GPx序列的76肽核苷酸序列， 并将原有非活性位点的半胱氨酸替换成其它氨基酸。
将合成得到的76肽核苷酸序列与pET22b质粒利用T4 DNA连接酶在16℃条件下进行过夜连接，构建带有76肽基因序列的重组载体pET22b-76P质粒。采用CaCl2方法将重组载体转入E.coli BL21（cysE51）感受态菌株中，转入含有50 ?g/mL Kana的LB固体培养基中在37℃条件下培养10h进行筛选，挑取单克隆在含有50 ?g/mL Kana的LB液体培养基中进行扩增培养，离心收集菌体沉淀提取pET22b-76P质粒，采用NdeⅠ和XbaⅠ限制性核酸内切酶对pET28b-76P质粒在37 ℃下分别进行单酶切和双酶切4 h，再用1%琼脂糖凝胶电泳进行酶切鉴定。 2.2 76肽的表達与条件优化
将复制成功pET22b-76P质粒转化于大肠杆菌E.coli BL21（cysE51）感受态细胞中，经过培养和抗性筛选鉴定，筛选出阳性重组子。然后配制半胱氨酸营养缺陷型表达所需培养基，即采用Sec替代蛋白中的所有Cys，进行Se-76P的表达[3]。通过优化菌体培养浓度、Cys终浓度、IPTG诱导剂浓度、诱导温度及诱导表达时间，IPTG诱导剂浓度梯度为千分之零点六、千分之零点八、千分之一、千分之一点二、千分之一点四，诱导温度梯度为26℃、28℃、30℃、32℃，诱导表达时间梯度为2h、3h、4h、5h、6h，先进行单因素试验，再进行正交试验，最终确定最优化的诱导表达条件，诱导表达出含硒76肽。SDS-PAGE鉴定含硒表达产物并用Ni2 离子螯合层析纯化[4]，纯化所用咪唑浓度梯度为50mM、100mM、150mM、300mM、500mM。最后用Western blotting鉴定[5]。利用试剂盒测定表达后的76肽的GPx和SOD活力。
3 结果分析
3.1 酶切鉴定结果
由限制性内切酶NdeⅠ和XbaⅠ单、双酶切后1%琼脂糖凝胶电泳鉴定后，单酶切得到一条明亮的条带且与重组质粒分子量大小一致，双酶切得到两条明亮的条带，两者之和等于重组质粒的大小，由此可知pColdⅠ（sp-4）-76P质粒构建成功。
3.2 SDS-PAGE电泳鉴定结果
由SDS-PAGE实验结果（图1，见18页）可知表达纯化所得到的蛋白分子量大小与预期一致，诱导前无目标条带，诱导后可以看到明显的目标条带，所以pET22b-76P质粒在E.coli BL21（cysE51）感受态菌株中有较好表达并成功纯化。
4 结论
本研究成功合成并表达了具有GPx和SOD双酶活性的含硒抗氧化肽，通过一系列的研究获得了此抗氧化肽的表达条件及生物信息学效应，为此后进一步的研究奠定了基础。
参考文献：
[1] Shin MC， Zhang J， Min KA， Lee K， Byun Y， David AE， He H， Yang VC. Cell-penetrating peptides：achievements and chal lenges in application for cancer treatment. J Biomed Mater Res A， 2014， 102（2）：575-587.
[2] Yan F， Yan GL， Lv SW， Shen N， Mu Y， Chen T， Gong PS， Xu YW， Lv LM， Liu JQ， Shen JC， Luo GM. Anovel 65-mer pep tide imitates the synergism of superoxide dismutase and gluta thione peroxidase[J]. Int J Biochem Cell Biol， 2011， 43： 1802- 1811.
【关键词】 双酶蛋白制备；蛋白表达；活性分析
[Abstract] In this study the artificial design was synthesized with SOD and GPx amino acid sequence of small peptide， the active site of target protein modification sites designed Cys， at the same time will not affect the structure of other sites of Cys become available from other amino acids 76 synthetic antioxidant peptide sequence of amino acids， and try to take advantage of e.c. with our fabrication： oli auxotroph expression system for the expression of 76 peptide analogues， and the expression of peptide activity appraisal， expectations for oxidation of simulation study provides some theoretical parameters.
[Key words] double enzyme protein preparation； protein expression； activity analysis
天然抗氧化酶稳定性差、来源受限且分子量较大等缺点一直限制其在各个领域的实际应用。由于抗氧化酶对维持正常生命活动的重要性，使得科学家们一直在利用模拟手段去设计并改造天然抗氧化酶，以便阐明酶催化反应机理和提高其实际应用价值。但机体内的抗氧化酶是通过协同作用来维持该系统平衡的，且进程也复杂多变，因此，对于单一功能酶的研究和模拟显然不能深入理解这个复杂的抗氧化酶系统，开展具有抗氧化能力的多功能酶的模拟势在必行[1]。
在此之前，我们利用近几年的时间对具有SOD和GPx活力的模拟酶进行了一部分研究，以SOD和GPx序列为基础，基于模块酶的设计理念，我们构建了一个具有谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶雙酶活性的含硒65肽，但由于其分子量较大，很难进入细胞内发挥作用。故此，我们在此65肽的氨基端连接上人免疫缺陷病毒反式转录激活因子的蛋白穿膜结构域的氨基酸序列，即细胞穿膜肽，使其具有穿透生物膜的能力，获得76肽模拟物，并在大肠杆菌中成功融合表达，再通过硒化，得到了具有SOD和GPx活力的模拟酶。
1 材料
1.1 试验材料
65P肽（HQHQFGDLSQGAESTGPHYNPLAVPHPQHPGDWGNFAVRDGSLWPFLRHVYGRPRACVV HAGED）由本实验室保留，大肠杆菌克隆菌株E. coli pET22b由本实验室保留。
1.2 主要试剂
核酸染料（SYBR?GreenⅠ）、核酸分子量标准（DL2000，DL15000 DNA Marker）购于TAKALA公司，T4 DNA连接酶购自MBI公司，胰蛋白胨、酵母粉、琼脂购于Oxiod公司；琼脂糖购于Promega 公司；异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside， IPTG）、氨苄青霉素（ampicillin， Amp）、卡那霉素（kanamycin， Kana）购于上海生工生物技术有限公司；小型质粒抽提试剂盒购于北京天根生化科技有限公司；限制性内切酶Xba I和Nde I购于大连宝生物公司；蛋白质Marker购于Solabio有限公司；DNA Marker 购于宝生物大连生物工程公司；四甲基二乙胺（TEMED）、考马斯亮蓝R-250、十二烷基磺酸钠、丙烯酰胺、过硫酸铵（APS）、甘氨酸、溴酚蓝（BPB）、Tris、甘油、醋酸、乙醇等其他生化试剂和常规试剂均为分析纯。
2 方法
2.1 76肽的构建与鉴定
在原有65P肽氨基酸序列的基础上，连接TAT穿膜肽（YGRKKRRQRRR）使其能穿透细胞膜并在细胞内发挥生物学效应[2]，对其蛋白质三维空间结构进行预测，构建76肽的初始三维结构。借助生物信息学软件Primer Premier 5.0的辅助下，合成含有SOD和GPx序列的76肽核苷酸序列， 并将原有非活性位点的半胱氨酸替换成其它氨基酸。
将合成得到的76肽核苷酸序列与pET22b质粒利用T4 DNA连接酶在16℃条件下进行过夜连接，构建带有76肽基因序列的重组载体pET22b-76P质粒。采用CaCl2方法将重组载体转入E.coli BL21（cysE51）感受态菌株中，转入含有50 ?g/mL Kana的LB固体培养基中在37℃条件下培养10h进行筛选，挑取单克隆在含有50 ?g/mL Kana的LB液体培养基中进行扩增培养，离心收集菌体沉淀提取pET22b-76P质粒，采用NdeⅠ和XbaⅠ限制性核酸内切酶对pET28b-76P质粒在37 ℃下分别进行单酶切和双酶切4 h，再用1%琼脂糖凝胶电泳进行酶切鉴定。 2.2 76肽的表達与条件优化
将复制成功pET22b-76P质粒转化于大肠杆菌E.coli BL21（cysE51）感受态细胞中，经过培养和抗性筛选鉴定，筛选出阳性重组子。然后配制半胱氨酸营养缺陷型表达所需培养基，即采用Sec替代蛋白中的所有Cys，进行Se-76P的表达[3]。通过优化菌体培养浓度、Cys终浓度、IPTG诱导剂浓度、诱导温度及诱导表达时间，IPTG诱导剂浓度梯度为千分之零点六、千分之零点八、千分之一、千分之一点二、千分之一点四，诱导温度梯度为26℃、28℃、30℃、32℃，诱导表达时间梯度为2h、3h、4h、5h、6h，先进行单因素试验，再进行正交试验，最终确定最优化的诱导表达条件，诱导表达出含硒76肽。SDS-PAGE鉴定含硒表达产物并用Ni2 离子螯合层析纯化[4]，纯化所用咪唑浓度梯度为50mM、100mM、150mM、300mM、500mM。最后用Western blotting鉴定[5]。利用试剂盒测定表达后的76肽的GPx和SOD活力。
3 结果分析
3.1 酶切鉴定结果
由限制性内切酶NdeⅠ和XbaⅠ单、双酶切后1%琼脂糖凝胶电泳鉴定后，单酶切得到一条明亮的条带且与重组质粒分子量大小一致，双酶切得到两条明亮的条带，两者之和等于重组质粒的大小，由此可知pColdⅠ（sp-4）-76P质粒构建成功。
3.2 SDS-PAGE电泳鉴定结果
由SDS-PAGE实验结果（图1，见18页）可知表达纯化所得到的蛋白分子量大小与预期一致，诱导前无目标条带，诱导后可以看到明显的目标条带，所以pET22b-76P质粒在E.coli BL21（cysE51）感受态菌株中有较好表达并成功纯化。
4 结论
本研究成功合成并表达了具有GPx和SOD双酶活性的含硒抗氧化肽，通过一系列的研究获得了此抗氧化肽的表达条件及生物信息学效应，为此后进一步的研究奠定了基础。
参考文献：
[1] Shin MC， Zhang J， Min KA， Lee K， Byun Y， David AE， He H， Yang VC. Cell-penetrating peptides：achievements and chal lenges in application for cancer treatment. J Biomed Mater Res A， 2014， 102（2）：575-587.
[2] Yan F， Yan GL， Lv SW， Shen N， Mu Y， Chen T， Gong PS， Xu YW， Lv LM， Liu JQ， Shen JC， Luo GM. Anovel 65-mer pep tide imitates the synergism of superoxide dismutase and gluta thione peroxidase[J]. Int J Biochem Cell Biol， 2011， 43： 1802- 1811.