目的：为研究10 kb以上DNA疫苗质粒的体内电穿孔递送，构建萤光素酶报告基因表达质粒pEE14.1-luc，并验证其表达。方法：从质粒pGL3-CMV中通过酶切、补平和纯化的方法获得萤光素酶基因luc，克隆入pEE14.1载体，构建重组表达质粒pEE14.1-luc，瞬时转染293T细胞，采用Western印迹、流式细胞术和免疫荧光等方法对萤光素酶基因在体外的表达情况进行验证，并运用活体成像仪检测萤光素酶基因在小鼠活体内的表达。结果：经菌液PCR鉴定和测序验证，pEE14.1-luc与预期设计完全一致；流式细胞术检测luc阳性表达率为22.41%，免疫荧光检测可见绿色荧光表达，Western印迹检测在相对分子质量为62×103处显现目的蛋白条带；同时，利用活体成像技术也检测到萤光素酶基因在小鼠活体内的表达。结论：pEE14.1-luc表达质粒构建成功，为研究DNA疫苗体内表达机制和体内电穿孔递送条件优化奠定了基础。