【摘 要】
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旨在以β-catenin/Lef1相互作用为靶标,建立基于ELISA原理的适用于靶向β-catenin/Lef1相互作用小分子抑制剂筛选的高通量筛选模型。利用DNA重组技术,将构建的β-catenin-pET
【机 构】
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皖南医学院药学院新药筛选与评价中心; 中国科学院长春应用化学研究所化学生物学实验室; 中国医学科学院-北京协和医学院医药生物技术研究所国家新药(微生物)筛选中心;
【基金项目】
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国家自然科学基金(No.81703546);安徽省自然科学基金(No.1808085QH265);吉林省科技发展计划(No.20160520045JH);皖南医学院博士科研启动基金(No.RCQD201617),皖南医学院大学生科研资助金(No.WK2018S54)资助~~
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旨在以β-catenin/Lef1相互作用为靶标,建立基于ELISA原理的适用于靶向β-catenin/Lef1相互作用小分子抑制剂筛选的高通量筛选模型。利用DNA重组技术,将构建的β-catenin-pET-30a(+)重组质粒转化大肠杆菌Escherichia coli Rosetta (DE3),经诱导培养后进行β-catenin原核表达。采用亲和层析方法分离纯化β-catenin后,以GSTPulldown实验进行生物学活性鉴定。利用ELISA原理建立β-catenin/GST-Lef1结合的分子模型,通过优选GST-Lef1最佳包被浓度和β-catenin最佳反应浓度,建立适用于靶向β-catenin/Lef1相互作用小分子抑制剂筛选的高通量筛选模型。SDS-PAGE和Western blotting实验证实β-catenin的原核表达。GST Pulldown实验证实纯化的β-catenin具有良好的生物学活性。通过对基于ELISA原理建立的β-catenin/GST-Lef1结合的分子模型优化,选用10μg/mL GST-Lef1和6μg/mLβ-catenin建立ELISA高通量筛选模型,其Z?因子为0.76。本研究成功建立了基于ELISA原理的β-catenin/GST-Lef1结合的分子模型,为靶向β-catenin/Lef1相互作用小分子抑制剂的高通量筛选奠定了基础。
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