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摘 要：目的：建立RP-HPLC法测定亚硫酸氢钠甲萘醌粉（水产用）的含量及其含量均匀度方法。方法：采用Agilent Eclipse Plus C18（15cm×4.6mm，5um）色谱柱，以0.015mol/L磷酸二氢钠溶液-甲醇（70∶30）为流动相，流速1.0mL/min，检测波长230nm。结果：在5～250μg/mL范围内，色谱峰面积与对照品浓度呈良好的线性关系，r=0.9998；回收率为100.2% （n=30）。结论：该法快速、简便、重现性好，可用于亚硫酸氢钠甲萘醌粉（水产用）的质量控制。
关键词：亚硫酸氢钠甲萘醌粉；含量均匀度；RP-HPLC法
中图分类号 R927 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2018）20-0035-3
Determination of the Content Uniformity of Menadione Sodium Bisulfite Powder （Aquaculture） - RP-HPLC Method
Chen Xiangdan et al.
（Hubei Institute for Veterinary Drug，Wuhan 430070，China）
Abstract：Purpose：To determine the content and content uniformity of Sodium Bisulfite naphthone quinone powder （aquaculture） by RP-HPLC. Methods： Agilent Eclipse Plus C18 （15cmx4.6mm， 5 um） column， with 0.015mol/L sodium dihydrogen phosphate methanol （70∶30） as the mobile phase， the flow rate of 1.0mL/min， the detection wavelength of 230nm. Results： In the range of 5 ～250μg/mL， the chromatographic peak area has a good linear relationship with the concentration of the control product， R =0.9998， and the recovery rate is 100.2% （n = 30）. Conclusion： The method is fast， simple and reproducible， and can be used for the quality control of Menadione Sodium Bisulfite powder （aquaculture）.
Key words：Menadione Sodium Bisulfite powder ；Content uniformity；RP-HPLC
亚硫酸氢钠甲萘醌为维生素类药物，主要作用为阻塞型黄疸、胆瘘、慢性腹泻，在动物肝脏内参与凝血酶的合成，促进凝血酶原的形成，加速凝血，维持正常的凝血时间，一般用于辅助治疗鱼、鳗、鳖等水产养殖动物的出血、败血症[1]。《兽药质量标准》2017年版化学药品卷收载的亚硫酸氢钠甲萘醌粉（水产用），其含量测定为提取甲萘醌后采用紫外分光光度法[2]。但由于亚硫酸氢钠甲萘醌粉（水产用）规格为1%，需测定含量的均匀度，上述方法较为繁杂，重现性和精密度都相对不高，不适用于含量均匀度测定。为此，本研究开展了高效液相色谱测定亚硫酸氢钠甲萘醌粉（水产用）的含量均匀度的方法的探索。
1 材料
1.1 仪器设备 岛津20AD高效液相色谱仪；Agilent Eclipse Plus C18色谱柱，4.6×150mm（i.d.），粒径 5μm；Mettler AE240 电子天平；MILIPORE 超纯水处理器等。
1.2 试剂与耗材 1%亚硫酸氢钠甲萘醌粉（水产用）样品为：（1）湖北武当动物药业有限公司生产，批号：140301；（2）湖北农科生物化学有限公司生产，批号：20150101；（3）湖南五指峰生化有限公司生产，批号：20150601。甲萘醌对照品：购于中国兽医药品监察所，含量为99.3%，批号：10029-0008；甲醇、乙腈均为色谱纯，水为超纯水，其他试剂为优级纯。
2 结果与分析
2.1 色谱条件与系统适应性试验 Agilent Eclipse Plus C18色谱柱，4.6×150mm，5μm）；流动相：0.15mol/L磷酸二氢钠溶液-甲醇（70∶30，用磷酸调节pH至4.8）；流速：1.0mL/min；检测波长：230nm；柱温：30℃；理论板数及分离度均应符合规定。
2.2 溶液的制备 避光操作。
2.2.1 对照品溶液的制备 取甲萘醌对照品约10mg，精密称定，置100mL量瓶中，用5mL甲醇溶解，加入10%亚硫酸氢钠溶液5mL，振摇1min，加水稀释至刻度，精密量取5mL，置50mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。
2.2.2 供试品溶液的制备 取供试品约0.5g，精密称定（约相当于亚硫酸氢钠甲萘醌5mg），置200mL量瓶中，加水适量，振摇使亚硫酸氢钠甲萘醌溶解，加入10%亚硫酸氢钠溶液1mL，并用水稀释至刻度，摇匀，滤过，作为供试品溶液。
2.3 含量及含量均匀度测定法 精密称取供试品10份按2.2.2方法制備供试品溶液，避光操作，按2.1项下的色谱条件试验。精密量对照品溶液及供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，测定。按外标法以峰面积计算，结果与1.918相乘，即得。 2.4 方法学考察
2.4.1 专属性 按2.1项下的色谱条件试验，分别量取对照品溶液、供试品溶液及空白对照溶液20μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果表明，空白辅料在亚硫酸氢钠甲萘醌峰相应的保留时间处无干扰。结果见图1～3。
2.4.2 线性 精密称取亚硫酸氢钠甲萘醌原料100mg，置200mL量瓶中，加水适量，振摇使亚硫酸氢钠甲萘醌溶解，加入10%亚硫酸氢钠溶液1mL，并用水稀释至刻度，摇匀，作为贮备液。分别精密量取贮备液适量，用水分别稀释至亚硫酸氢钠甲萘醌浓度为5、10、25、50、100、250μg/mL的溶液，各取20μL进样，记录色谱图，以浓度（C，mg/mL）为横坐标，峰面积（mV）为纵坐标进行线性回归（结果见图4），得回归方程：Y=56624X-5531.4，r=0.9998。可见在此色谱条件下亚硫酸氢钠甲萘醌在5～250μg/mL范围内线性良好。
2.4.3 精密度试验 取对照品溶液（甲萘醌10μg/mL），按2.2色谱条件进行测定，连续进样6次，测得甲萘醌峰面積平均值为1396746，RSD为0.5%。
2.4.4 回收率试验 按处方比例配制1%的亚硫酸氢钠甲萘醌粉，分别精密称取约16mg、20mg和24mg的亚硫酸氢钠甲萘醌原料及约2g的辅料置200mL具塞容量瓶中，按2.2色谱条件进行测定（进样量改为5μL），按外标法计算亚硫酸氢钠甲萘醌的含量，计算回收率（测定结果见表1）。
2.4.5 稳定性试验 取对照品溶液（甲萘醌10μg/mL），按2.2色谱条件进行测定，室温下，在不同时间（0，2，4，6，8，10，12h）分别进行测定，测得甲萘醌峰面积平均值为1420088，RSD为0.7%，表明供试品溶液在室温下放置12h稳定。
2.4.6 1%亚硫酸氢钠甲萘醌粉（水产用）样品的含量测定 分别取同一厂家不同批号的样品，采用2.2色谱条件进行测定含量及含量均匀度，结果均符合规定。样品含量测定结果如表2。
3 讨论与结论
（1）检测波长的确定：取上述用亚硫酸氢钠甲萘醌原料制成的对照溶液、甲萘醌对照品制成的对照溶液和供试品溶液各20μL，注入高效液相色谱仪，以DAD检测器在200～400nm波长处记录色谱图，作峰纯度检査，其色谱图中的主峰为一纯物质峰。峰纯度检査的高效液相光谱图谱显示，亚硫酸氢钠甲蔡醌在230nm的波长处有最大吸收，故选择230nm为检测波长，检测灵敏度较高[3]。
（2）由于亚硫酸氢钠甲萘醌粉（水产用）为规格小于2%的粉剂，按目前标准规定的方法测定含量均匀度存在诸多影响结果准确的因素，本文采用反相高效液相色谱法测定含量均匀度，具有简便、快速、重现性好的特点，极大地提高了工作效率，并节约了人力物力，能准确反映1%规格亚硫酸氢钠甲萘醌粉（水产用）的含量及含量均匀度，可用于该制剂含量及含量均匀度测定的质量控制。
参考文献
[1]中国兽药典委员会.《兽药质量标准》2017年版（化学药品卷）[S].
[2]中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典二○一五年版一部[S].
[3]张伟，程辉跃，金竹，等.HPLC法测定亚硫酸氢钠甲萘醌片的含量[J].药物分析杂志，2005，25（12）：1567-1569.
（责编：张宏民）
关键词：亚硫酸氢钠甲萘醌粉；含量均匀度；RP-HPLC法
中图分类号 R927 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2018）20-0035-3
Determination of the Content Uniformity of Menadione Sodium Bisulfite Powder （Aquaculture） - RP-HPLC Method
Chen Xiangdan et al.
（Hubei Institute for Veterinary Drug，Wuhan 430070，China）
Abstract：Purpose：To determine the content and content uniformity of Sodium Bisulfite naphthone quinone powder （aquaculture） by RP-HPLC. Methods： Agilent Eclipse Plus C18 （15cmx4.6mm， 5 um） column， with 0.015mol/L sodium dihydrogen phosphate methanol （70∶30） as the mobile phase， the flow rate of 1.0mL/min， the detection wavelength of 230nm. Results： In the range of 5 ～250μg/mL， the chromatographic peak area has a good linear relationship with the concentration of the control product， R =0.9998， and the recovery rate is 100.2% （n = 30）. Conclusion： The method is fast， simple and reproducible， and can be used for the quality control of Menadione Sodium Bisulfite powder （aquaculture）.
Key words：Menadione Sodium Bisulfite powder ；Content uniformity；RP-HPLC
亚硫酸氢钠甲萘醌为维生素类药物，主要作用为阻塞型黄疸、胆瘘、慢性腹泻，在动物肝脏内参与凝血酶的合成，促进凝血酶原的形成，加速凝血，维持正常的凝血时间，一般用于辅助治疗鱼、鳗、鳖等水产养殖动物的出血、败血症[1]。《兽药质量标准》2017年版化学药品卷收载的亚硫酸氢钠甲萘醌粉（水产用），其含量测定为提取甲萘醌后采用紫外分光光度法[2]。但由于亚硫酸氢钠甲萘醌粉（水产用）规格为1%，需测定含量的均匀度，上述方法较为繁杂，重现性和精密度都相对不高，不适用于含量均匀度测定。为此，本研究开展了高效液相色谱测定亚硫酸氢钠甲萘醌粉（水产用）的含量均匀度的方法的探索。
1 材料
1.1 仪器设备 岛津20AD高效液相色谱仪；Agilent Eclipse Plus C18色谱柱，4.6×150mm（i.d.），粒径 5μm；Mettler AE240 电子天平；MILIPORE 超纯水处理器等。
1.2 试剂与耗材 1%亚硫酸氢钠甲萘醌粉（水产用）样品为：（1）湖北武当动物药业有限公司生产，批号：140301；（2）湖北农科生物化学有限公司生产，批号：20150101；（3）湖南五指峰生化有限公司生产，批号：20150601。甲萘醌对照品：购于中国兽医药品监察所，含量为99.3%，批号：10029-0008；甲醇、乙腈均为色谱纯，水为超纯水，其他试剂为优级纯。
2 结果与分析
2.1 色谱条件与系统适应性试验 Agilent Eclipse Plus C18色谱柱，4.6×150mm，5μm）；流动相：0.15mol/L磷酸二氢钠溶液-甲醇（70∶30，用磷酸调节pH至4.8）；流速：1.0mL/min；检测波长：230nm；柱温：30℃；理论板数及分离度均应符合规定。
2.2 溶液的制备 避光操作。
2.2.1 对照品溶液的制备 取甲萘醌对照品约10mg，精密称定，置100mL量瓶中，用5mL甲醇溶解，加入10%亚硫酸氢钠溶液5mL，振摇1min，加水稀释至刻度，精密量取5mL，置50mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。
2.2.2 供试品溶液的制备 取供试品约0.5g，精密称定（约相当于亚硫酸氢钠甲萘醌5mg），置200mL量瓶中，加水适量，振摇使亚硫酸氢钠甲萘醌溶解，加入10%亚硫酸氢钠溶液1mL，并用水稀释至刻度，摇匀，滤过，作为供试品溶液。
2.3 含量及含量均匀度测定法 精密称取供试品10份按2.2.2方法制備供试品溶液，避光操作，按2.1项下的色谱条件试验。精密量对照品溶液及供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，测定。按外标法以峰面积计算，结果与1.918相乘，即得。 2.4 方法学考察
2.4.1 专属性 按2.1项下的色谱条件试验，分别量取对照品溶液、供试品溶液及空白对照溶液20μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果表明，空白辅料在亚硫酸氢钠甲萘醌峰相应的保留时间处无干扰。结果见图1～3。
2.4.2 线性 精密称取亚硫酸氢钠甲萘醌原料100mg，置200mL量瓶中，加水适量，振摇使亚硫酸氢钠甲萘醌溶解，加入10%亚硫酸氢钠溶液1mL，并用水稀释至刻度，摇匀，作为贮备液。分别精密量取贮备液适量，用水分别稀释至亚硫酸氢钠甲萘醌浓度为5、10、25、50、100、250μg/mL的溶液，各取20μL进样，记录色谱图，以浓度（C，mg/mL）为横坐标，峰面积（mV）为纵坐标进行线性回归（结果见图4），得回归方程：Y=56624X-5531.4，r=0.9998。可见在此色谱条件下亚硫酸氢钠甲萘醌在5～250μg/mL范围内线性良好。
2.4.3 精密度试验 取对照品溶液（甲萘醌10μg/mL），按2.2色谱条件进行测定，连续进样6次，测得甲萘醌峰面積平均值为1396746，RSD为0.5%。
2.4.4 回收率试验 按处方比例配制1%的亚硫酸氢钠甲萘醌粉，分别精密称取约16mg、20mg和24mg的亚硫酸氢钠甲萘醌原料及约2g的辅料置200mL具塞容量瓶中，按2.2色谱条件进行测定（进样量改为5μL），按外标法计算亚硫酸氢钠甲萘醌的含量，计算回收率（测定结果见表1）。
2.4.5 稳定性试验 取对照品溶液（甲萘醌10μg/mL），按2.2色谱条件进行测定，室温下，在不同时间（0，2，4，6，8，10，12h）分别进行测定，测得甲萘醌峰面积平均值为1420088，RSD为0.7%，表明供试品溶液在室温下放置12h稳定。
2.4.6 1%亚硫酸氢钠甲萘醌粉（水产用）样品的含量测定 分别取同一厂家不同批号的样品，采用2.2色谱条件进行测定含量及含量均匀度，结果均符合规定。样品含量测定结果如表2。
3 讨论与结论
（1）检测波长的确定：取上述用亚硫酸氢钠甲萘醌原料制成的对照溶液、甲萘醌对照品制成的对照溶液和供试品溶液各20μL，注入高效液相色谱仪，以DAD检测器在200～400nm波长处记录色谱图，作峰纯度检査，其色谱图中的主峰为一纯物质峰。峰纯度检査的高效液相光谱图谱显示，亚硫酸氢钠甲蔡醌在230nm的波长处有最大吸收，故选择230nm为检测波长，检测灵敏度较高[3]。
（2）由于亚硫酸氢钠甲萘醌粉（水产用）为规格小于2%的粉剂，按目前标准规定的方法测定含量均匀度存在诸多影响结果准确的因素，本文采用反相高效液相色谱法测定含量均匀度，具有简便、快速、重现性好的特点，极大地提高了工作效率，并节约了人力物力，能准确反映1%规格亚硫酸氢钠甲萘醌粉（水产用）的含量及含量均匀度，可用于该制剂含量及含量均匀度测定的质量控制。
参考文献
[1]中国兽药典委员会.《兽药质量标准》2017年版（化学药品卷）[S].
[2]中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典二○一五年版一部[S].
[3]张伟，程辉跃，金竹，等.HPLC法测定亚硫酸氢钠甲萘醌片的含量[J].药物分析杂志，2005，25（12）：1567-1569.
（责编：张宏民）