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摘 要：目前我国棉花品种多、乱、杂现象较为严重，对棉农收益和棉花品质造成不利影响。田间种植鉴定已不能完全满足棉种质量管控的需求。SSR检测技术可以从分子水平给予每个棉花品种唯一的“身份证明”，成为棉种鉴定较先进的技术和发展趋势。简要介绍了SSR分子检测在棉花品种鉴定中的研究进展，同时探讨了SSR分子检测技术还存在的一些问题，希望对以后的研究有所參考。
关键词：棉种;SSR分子检测;品种鉴定;研究进展
文章编号： 1005-2690（2018）12-0108-02 中图分类号： S562 文献标志码： B
长久以来，棉种的纯度与真实性鉴定停留在一些传统方法上，如田间种植鉴定法，其需要投入大量的物力、人力，且时效性差，易受人为和环境的影响，制约了对棉种的质量管控。随着分子生物学技术的发展，利用SSR分子检测技术进行品种真伪与纯度鉴定已成为发展趋势，国际植物新品种权保护联盟在分子测试指南中，将构建DNA指纹数据库的标记方法确定为SSR[1]。
1 SSR分子标记原理
SSR（简单重复序列，Simple Sequence Repeat）是由几个核苷酸组成的短序列首尾连接重复多次构成，在作物DNA中串联重复排列[2]。每个SSR侧翼序列通常是同一作物品种中相对保守的单拷贝序列，由该序列可设计出一对互补寡聚核苷酸引物，再经过SSR-PCR扩增，其产物通过电泳检测可显示出不同品种间重复次数的差异。
2 研究进展
2.1 检测体系的优化
SSR分子技术鉴定棉种的真实性和纯度的一般步骤分为棉种DNA提取、PCR扩增、PAGE凝胶电泳及银染。在棉种DNA提取方法上，宋国立等[3]提出了改良的CTAB法，该法能够较好地去除DNA中的棉酚、单宁等物质。高文伟等[4]采用改良的SDS-CTAB法，不需要多次酚-氯仿抽提，得到了高质量的棉花DNA，是一种高效简洁的DNA提取法。然而以上方法都是以棉花组织或叶片为试验材料，不能满足鉴定要求的时效性。匡猛等[5]开发了一种直接以棉籽为材料，只需两次酚-氯仿-异戊醇抽提获得棉种DNA的方法，其显著提高了检测的时效性。
在反应条件上，田海燕等[6]指出，DNA纯度、退火温度（Tm）、镁离子浓度是影响扩增体系最关键的条件，而同一引物对于不同品种的退火温度不同，且在退火温度允许的范围内，较高的Tm可有效降低模板与引物之间的非特异性结合，增强扩增反应的特异性[7]。经过大量试验探索将扩增反应程序设置为：94 ℃预变性4 min，1个循环;94 ℃变性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，共32个循环;72 ℃延伸12 min，1个循环;4 ℃放置备用。
电泳检测方法有3种，即琼脂糖电泳、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳与变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。其中，琼脂糖凝胶对PCR扩增产物分辨度最低，大小100～300 bp，非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳次之，而变性聚丙烯酰胺凝胶分辨率最低，可达1 bp[8]。非变性胶操作简单，但往往会检测到杂合链，因此常检测出假阳性谱带;变性胶检测出的是单链，没有杂合链，条带清晰，等位基因类型丰富，但是操作相对烦琐[9]。对于品种差异性鉴定来说，存在较小差别的DNA扩增产物琼脂糖凝胶电泳和非变性凝胶电泳较难分辨，只有变性胶凝胶电泳更适合品种差异性鉴定。鉴定材料从叶片发展到种子，适应了检测过程时效性的要求;PCR反应参数和检测平台的优化使得鉴定结果更加真实可靠。总之，试验体系的不断改善，为棉种SSR分子检测奠定了基础。
2.2 核心引物的筛选及应用
核心引物筛选是棉种分子检测技术中最基础也是最关键的一步，其也是构建DNA标准指纹图谱的前提条件。在主要农作物中，水稻和玉米制订了DNA指纹方法的两个行业标准（《NYT 1432—2007玉米品种鉴定DNA指纹方法》和《NYT 1433—2007水稻品种鉴定 DNA 指纹方法》），并得到了广泛应用。然而棉花是常异花授粉异源四倍体作物[10]，自然混杂相对比较严重，其标准的制订相较其他作物更为困难。匡猛等[11]以32份棉花主栽品种为材料，对214对SSR引物进行筛选，得到36对在染色体上分布均匀的核心引物，将差异位点大于或等于2个的样品判定为杂株，并指出在品种鉴定上最少采用5对引物相组合即可将32个棉花品种完全区分开。付小琼等[12]研究认为，当2个以上引物谱带与其他样品不一致时，则判定其为杂株，且田间性状表现与SSR标记检测结果有较高吻合度。王飞等[13]采用52对核心引物对7个棉花品种进行了SSR分析，初步将大于或等于3个差异位点的样品判定为杂株，并对棉种中的非纯位点现象进行了分析。
笔者认为，对于棉花杂株的SSR判定方法，要充分验证田间鉴定与DNA分子检测的结果，将待测样品中杂株的差异位点阈值限定在更精确范围内，以提高棉种纯度分子检测的准确性。而核心引物数量还需进一步探讨，品种纯度检测可以说是一个鉴别不同品种的过程，因此应选择能够有效区分混杂种子的标记。
3 问题与展望
棉种真实性和品种纯度鉴定是确保种子质量安全的重要手段之一。从棉种的遗传物质特性上，即利用SSR的多态性能够对品种间和同一品种内遗传变异进行准确的分析。然而，在分子检测真实性方法上还存在一些问题需要解决，例如真实性鉴定过程中差异位点阈值的问题，在《玉米品种真实性SSR鉴定技术规范》中规定：若待测品种和标准品种至少需要比较20个单株的特征带型，若两份样品相同谱带的单株比例达到20%以上，则该位点无差异为真实品种，反之为假品种。在棉种分子检测标准制定中，可参考玉米的鉴定规范，再结合棉花自身特性，探索出适用于主栽棉花品种的差异位点判定方法。 棉种真实性和纯度分子检测技术的完善还需借鉴其他作物的成功经验，不断探索总结。总之，SSR检测技术为棉花品种分子检测方法开辟了一条全新路径，为我国棉种质量安全提供了可靠的技术保障。
参考文献：
[ 1 ] 董薇.棉花种质资源遗传多样性及其SSR丰度分析[D].北京：中国农业科学院，2007.
[ 2 ] UPOV （Union for the Protection of New Varieties of Plants）.Guidelines for molecular marker selection and database cons-truction[J].BMT Guidelines （proj.3）， 2005：3-6.
[ 3 ] 宋国立，崔荣霞，王坤波，等.改良CTAB法快速提取棉花DNA[J].棉花学报，1998，10（05）：273-275.
[ 4 ] 高文伟，陈全家，曲延英，等.棉花DNA提取及优化SSR反应体系的建立和应用[J].新疆农业大学学报，2009，32（06）：34-37.
[ 5 ] 匡猛，杨伟华，许红霞，等.单粒棉花种子DNA快速提取方法[J].分子植物育种，2010，8（04）：827-831.
[ 6 ] 田海燕，田新惠，李艳军，等.棉花DNA的提取及其SSR分子标记体系的建立[J].石河子大学学报：自然科学版，2007，25（02）：150-152.
[ 7 ] 陈勋基，葛峰，屈喜军，等.棉花SSR分子标记体系优化研究[J].新疆农业科学，2008，45（01）：66-69.
[ 8 ] 王凤格，赵久然，戴景瑞，等.玉米品种DNA指纹数据库构建的标准化规范[J].分子植物育种，2007，5（01）：128-132.
[ 9 ] 王飞.SSR分子标记在棉种真实性和纯度鉴定中的应用研究[D].北京：中国农业科学院，2013.
[ 10 ] 张凤娇.异源四倍体棉花海陆种间遗传图谱构建[D].重庆： 西南大学，2014.
[ 11 ] 匡猛，杨伟华，许红霞，等.中国棉花主栽品种DNA指纹图 谱构建及SSR标记遗传多样性分析[J].中国农业科学，2011， 44（01）：20-27.
[ 12 ] 付小琼，杨付新，刘逢举，等.棉花总DNA快速提取技术及 其在国家棉花区试中的应用[J].中国棉花 学会，2011： 124-127.
[ 13 ] 王飛，匡猛，许红霞，等.7个棉花品种 SSR位点纯合度研究与分析[J].棉花学 报，2013，25（03）：234-239.
（收稿日期：2018-11-12）
关键词：棉种;SSR分子检测;品种鉴定;研究进展
文章编号： 1005-2690（2018）12-0108-02 中图分类号： S562 文献标志码： B
长久以来，棉种的纯度与真实性鉴定停留在一些传统方法上，如田间种植鉴定法，其需要投入大量的物力、人力，且时效性差，易受人为和环境的影响，制约了对棉种的质量管控。随着分子生物学技术的发展，利用SSR分子检测技术进行品种真伪与纯度鉴定已成为发展趋势，国际植物新品种权保护联盟在分子测试指南中，将构建DNA指纹数据库的标记方法确定为SSR[1]。
1 SSR分子标记原理
SSR（简单重复序列，Simple Sequence Repeat）是由几个核苷酸组成的短序列首尾连接重复多次构成，在作物DNA中串联重复排列[2]。每个SSR侧翼序列通常是同一作物品种中相对保守的单拷贝序列，由该序列可设计出一对互补寡聚核苷酸引物，再经过SSR-PCR扩增，其产物通过电泳检测可显示出不同品种间重复次数的差异。
2 研究进展
2.1 检测体系的优化
SSR分子技术鉴定棉种的真实性和纯度的一般步骤分为棉种DNA提取、PCR扩增、PAGE凝胶电泳及银染。在棉种DNA提取方法上，宋国立等[3]提出了改良的CTAB法，该法能够较好地去除DNA中的棉酚、单宁等物质。高文伟等[4]采用改良的SDS-CTAB法，不需要多次酚-氯仿抽提，得到了高质量的棉花DNA，是一种高效简洁的DNA提取法。然而以上方法都是以棉花组织或叶片为试验材料，不能满足鉴定要求的时效性。匡猛等[5]开发了一种直接以棉籽为材料，只需两次酚-氯仿-异戊醇抽提获得棉种DNA的方法，其显著提高了检测的时效性。
在反应条件上，田海燕等[6]指出，DNA纯度、退火温度（Tm）、镁离子浓度是影响扩增体系最关键的条件，而同一引物对于不同品种的退火温度不同，且在退火温度允许的范围内，较高的Tm可有效降低模板与引物之间的非特异性结合，增强扩增反应的特异性[7]。经过大量试验探索将扩增反应程序设置为：94 ℃预变性4 min，1个循环;94 ℃变性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，共32个循环;72 ℃延伸12 min，1个循环;4 ℃放置备用。
电泳检测方法有3种，即琼脂糖电泳、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳与变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。其中，琼脂糖凝胶对PCR扩增产物分辨度最低，大小100～300 bp，非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳次之，而变性聚丙烯酰胺凝胶分辨率最低，可达1 bp[8]。非变性胶操作简单，但往往会检测到杂合链，因此常检测出假阳性谱带;变性胶检测出的是单链，没有杂合链，条带清晰，等位基因类型丰富，但是操作相对烦琐[9]。对于品种差异性鉴定来说，存在较小差别的DNA扩增产物琼脂糖凝胶电泳和非变性凝胶电泳较难分辨，只有变性胶凝胶电泳更适合品种差异性鉴定。鉴定材料从叶片发展到种子，适应了检测过程时效性的要求;PCR反应参数和检测平台的优化使得鉴定结果更加真实可靠。总之，试验体系的不断改善，为棉种SSR分子检测奠定了基础。
2.2 核心引物的筛选及应用
核心引物筛选是棉种分子检测技术中最基础也是最关键的一步，其也是构建DNA标准指纹图谱的前提条件。在主要农作物中，水稻和玉米制订了DNA指纹方法的两个行业标准（《NYT 1432—2007玉米品种鉴定DNA指纹方法》和《NYT 1433—2007水稻品种鉴定 DNA 指纹方法》），并得到了广泛应用。然而棉花是常异花授粉异源四倍体作物[10]，自然混杂相对比较严重，其标准的制订相较其他作物更为困难。匡猛等[11]以32份棉花主栽品种为材料，对214对SSR引物进行筛选，得到36对在染色体上分布均匀的核心引物，将差异位点大于或等于2个的样品判定为杂株，并指出在品种鉴定上最少采用5对引物相组合即可将32个棉花品种完全区分开。付小琼等[12]研究认为，当2个以上引物谱带与其他样品不一致时，则判定其为杂株，且田间性状表现与SSR标记检测结果有较高吻合度。王飞等[13]采用52对核心引物对7个棉花品种进行了SSR分析，初步将大于或等于3个差异位点的样品判定为杂株，并对棉种中的非纯位点现象进行了分析。
笔者认为，对于棉花杂株的SSR判定方法，要充分验证田间鉴定与DNA分子检测的结果，将待测样品中杂株的差异位点阈值限定在更精确范围内，以提高棉种纯度分子检测的准确性。而核心引物数量还需进一步探讨，品种纯度检测可以说是一个鉴别不同品种的过程，因此应选择能够有效区分混杂种子的标记。
3 问题与展望
棉种真实性和品种纯度鉴定是确保种子质量安全的重要手段之一。从棉种的遗传物质特性上，即利用SSR的多态性能够对品种间和同一品种内遗传变异进行准确的分析。然而，在分子检测真实性方法上还存在一些问题需要解决，例如真实性鉴定过程中差异位点阈值的问题，在《玉米品种真实性SSR鉴定技术规范》中规定：若待测品种和标准品种至少需要比较20个单株的特征带型，若两份样品相同谱带的单株比例达到20%以上，则该位点无差异为真实品种，反之为假品种。在棉种分子检测标准制定中，可参考玉米的鉴定规范，再结合棉花自身特性，探索出适用于主栽棉花品种的差异位点判定方法。 棉种真实性和纯度分子检测技术的完善还需借鉴其他作物的成功经验，不断探索总结。总之，SSR检测技术为棉花品种分子检测方法开辟了一条全新路径，为我国棉种质量安全提供了可靠的技术保障。
参考文献：
[ 1 ] 董薇.棉花种质资源遗传多样性及其SSR丰度分析[D].北京：中国农业科学院，2007.
[ 2 ] UPOV （Union for the Protection of New Varieties of Plants）.Guidelines for molecular marker selection and database cons-truction[J].BMT Guidelines （proj.3）， 2005：3-6.
[ 3 ] 宋国立，崔荣霞，王坤波，等.改良CTAB法快速提取棉花DNA[J].棉花学报，1998，10（05）：273-275.
[ 4 ] 高文伟，陈全家，曲延英，等.棉花DNA提取及优化SSR反应体系的建立和应用[J].新疆农业大学学报，2009，32（06）：34-37.
[ 5 ] 匡猛，杨伟华，许红霞，等.单粒棉花种子DNA快速提取方法[J].分子植物育种，2010，8（04）：827-831.
[ 6 ] 田海燕，田新惠，李艳军，等.棉花DNA的提取及其SSR分子标记体系的建立[J].石河子大学学报：自然科学版，2007，25（02）：150-152.
[ 7 ] 陈勋基，葛峰，屈喜军，等.棉花SSR分子标记体系优化研究[J].新疆农业科学，2008，45（01）：66-69.
[ 8 ] 王凤格，赵久然，戴景瑞，等.玉米品种DNA指纹数据库构建的标准化规范[J].分子植物育种，2007，5（01）：128-132.
[ 9 ] 王飞.SSR分子标记在棉种真实性和纯度鉴定中的应用研究[D].北京：中国农业科学院，2013.
[ 10 ] 张凤娇.异源四倍体棉花海陆种间遗传图谱构建[D].重庆： 西南大学，2014.
[ 11 ] 匡猛，杨伟华，许红霞，等.中国棉花主栽品种DNA指纹图 谱构建及SSR标记遗传多样性分析[J].中国农业科学，2011， 44（01）：20-27.
[ 12 ] 付小琼，杨付新，刘逢举，等.棉花总DNA快速提取技术及 其在国家棉花区试中的应用[J].中国棉花 学会，2011： 124-127.
[ 13 ] 王飛，匡猛，许红霞，等.7个棉花品种 SSR位点纯合度研究与分析[J].棉花学 报，2013，25（03）：234-239.
（收稿日期：2018-11-12）