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肺纤维化是以肺泡及间质性炎症起病、继以肺泡结构进行性损害、细胞外基质蛋白胶原沉积为特征的慢性炎症性疾病,其分为两个阶段,即早期肺泡炎阶段及后期炎症损伤后过度修复的肺纤维化阶段。其发病原因复杂,发病机制尚未完全阐明。目前多认为在肺泡炎性过程中,由肺脏巨噬细胞分泌和多种细胞因子如TNF-α、IL-l、TGF-a等起到重要作用,这些细胞因子相互之间影响,参与肺泡炎症和肺纤维化的形成。目前临床上雷公藤药物已被用于临床治疗肺纤维化,并取得一定的效果。昆仙胶囊方要成份为昆明山海棠,属于雷公藤类药物。本实验通过研究昆仙胶囊对肺纤维化的作用及TNF-α的作用,以探讨其作用机制。
1 材料和方法
1.1 实验动物 健康清洁级Wistar,雄性,购于河南省动物实验中心,年龄:3个月。
1.2 药物与试剂 博来霉素购于浙江海正药业股份有限公司,批号:国药准字H20080605。昆仙胶囊广州陈李济药厂批号:国药准字Z20060267。TNF-α免疫试剂盒购于上海沪峰生物科技有限公司。
1.3 动物模型制作
大鼠在实验室饲养1周,采用氯胺酮麻醉,无菌条件下作气管切开,模型组和实验组气管内一次性给予博来霉素(5 mg/kg),对照组给予生理盐水0.2 ml。给药后,大鼠直立并旋转,使药物充满肺部。
1.4 动物分组及给药
模型制作成功后,随机分为模型组、昆仙组。分别每天给予生理盐水2 ml、昆仙胶囊7.5 mg/kg灌胃。
1.5 标本采集
各组大鼠分别于术后 第7、28 d各处死6只。剖胸取肺并称重,取左下肺叶固定于10%的福尔马林溶液中,供HE染色、Masson染色和免疫组化应用。
1.6 TNF-α测定 采用Elisa 双抗体夹心法检测肺内TNF-α的表达。
1.7 结果判定 HE染色采用Szapiel[1]法判断组织病理变化程度。在光镜下观察HE染色和Masson染色病理切片分别评价肺泡炎和肺纤维化和程度,均分为4级。肺泡炎分级:0级:无肺泡炎;1级:轻度肺泡炎,肺泡隔因细胞浸润增宽,病变范围局限在全肺20%以下,肺泡结构正常;2级:中度肺泡炎,病变范围占全肺的20%~50%;3级:重度肺泡炎,成弥漫性分布,病变范围大于50%。肺纤维化分级:0级:无肺纤维化;1级:轻度肺纤维化,受累面积少于全肺20%;2级:中度肺纤维化,受累面积占全肺20%~50%,肺泡结构紊乱;3级:重度肺纤维化,受累面积大于,50%,肺泡融合,肺实质结构紊乱。
1.8 统计学方法 数据均以(x±s)表示,采用SPSS13.0统计软件包,行方差分析及q检验,P<0.05为差异有统计学意义。
2 实验结果
2.1 一般观察,实验期间对各组大鼠进行一般情况、精神状况等大体观察。对照组大鼠生长良好,除体重自然增长外,无异常改变;模型组大鼠死亡两只,有体重减轻、体毛倒伏、行为异常等反应。昆仙胶囊组无死亡。等的方法
2.2 根据Szapiel[1]等的方法,模型组:7 d时肺泡炎性改变明显,HE染色可见肺间质及肺泡内有大量炎性细胞浸润,以巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞为主,肺泡间隔增宽,伴有水肿和出血。Masson染色见肺泡间隔增宽明显,胶原纤维增多,肺泡结构改变。28 d时,肺泡炎症减轻,但间质内仍有巨噬细胞浸润,成纤维细胞大量聚集,肺泡结构破坏,间隔增宽,并且炎症、纤维化、肺泡出血并见;Masson染色见大量胶原纤维呈束状或者片状沉积,肺泡壁变厚,肺泡结构紊乱。昆仙胶囊组各时间点与博来霉素组比较表现出基本一致的变化规律,但肺泡炎和纤维化和程度较轻。具体积分如下。
2.3 TNF-α细胞因子测定 模型组TNF-α与对照组相比水平升高(P<0.05),昆仙胶囊组TNF-α水平明显低于模型组(P<0.05)。见表2。
3 讨论
肺纤维化是由多种因素引起的难治性肺脏病变,其中自身免疫因素起到重要作用。近年来的研究主要集中在多种与自身相关的细胞因子与肺纤维化的关系。雷公藤药物是临床常用来治疗类风湿关节炎等自身免疫性疾病的中药,近年来研究发现其对肺纤维化具有较好的作用。昆仙胶囊主要成份为昆明山海棠提取物,具有较好的抗炎镇痛及抗自身免疫效果。从上述结果可知,昆仙胶囊在第1周起时具有明显的减轻肺泡炎症的效果,并开发发挥减轻肺纤维化的作用,并在第4周具有较明显的作用。
TNF-α广泛参与到炎症与自身免疫和各个环节,并具有刺激纖维组织增生的作用。静脉注射TNF-α可引起弥漫性肺泡损伤,以肺泡上皮细胞和内皮细胞坏死为主要表现。应用抗TNF-α抗体能使小鼠免于患博莱霉素(BIM)引起的肺间质炎症和纤维化,有学者发现,BIM气管注射后肺组织总TNF-α含量均较对照组明显增加,本实验结果表明,模型组大鼠TNF-α水平均明显增加,虽然其表达水平随着时间延长下降,但仍持续高于空白对照组。而昆仙胶囊治疗组水平与模型组差异有统计学意义,提示抗自身免疫是临床应用免疫抵制药物治疗纤维化的基础,而TNF-α作为自身免疫和炎症环节中重要的细胞因子,可能是自身免疫药物起作用的环节之一。昆仙胶囊可消除炎症递质,减少炎性细胞因子TNF-α的释放,从而达到防止肺纤维化的作用。
参考文献
[1] Szapiel SV,ElsonNA,FulmarJD,et al.Bleorrmjcirrinduced interstial Pulmonary disease in the nude,athymic mouse.Am Rev Respir Dis,1979,120:893-894.
1 材料和方法
1.1 实验动物 健康清洁级Wistar,雄性,购于河南省动物实验中心,年龄:3个月。
1.2 药物与试剂 博来霉素购于浙江海正药业股份有限公司,批号:国药准字H20080605。昆仙胶囊广州陈李济药厂批号:国药准字Z20060267。TNF-α免疫试剂盒购于上海沪峰生物科技有限公司。
1.3 动物模型制作
大鼠在实验室饲养1周,采用氯胺酮麻醉,无菌条件下作气管切开,模型组和实验组气管内一次性给予博来霉素(5 mg/kg),对照组给予生理盐水0.2 ml。给药后,大鼠直立并旋转,使药物充满肺部。
1.4 动物分组及给药
模型制作成功后,随机分为模型组、昆仙组。分别每天给予生理盐水2 ml、昆仙胶囊7.5 mg/kg灌胃。
1.5 标本采集
各组大鼠分别于术后 第7、28 d各处死6只。剖胸取肺并称重,取左下肺叶固定于10%的福尔马林溶液中,供HE染色、Masson染色和免疫组化应用。
1.6 TNF-α测定 采用Elisa 双抗体夹心法检测肺内TNF-α的表达。
1.7 结果判定 HE染色采用Szapiel[1]法判断组织病理变化程度。在光镜下观察HE染色和Masson染色病理切片分别评价肺泡炎和肺纤维化和程度,均分为4级。肺泡炎分级:0级:无肺泡炎;1级:轻度肺泡炎,肺泡隔因细胞浸润增宽,病变范围局限在全肺20%以下,肺泡结构正常;2级:中度肺泡炎,病变范围占全肺的20%~50%;3级:重度肺泡炎,成弥漫性分布,病变范围大于50%。肺纤维化分级:0级:无肺纤维化;1级:轻度肺纤维化,受累面积少于全肺20%;2级:中度肺纤维化,受累面积占全肺20%~50%,肺泡结构紊乱;3级:重度肺纤维化,受累面积大于,50%,肺泡融合,肺实质结构紊乱。
1.8 统计学方法 数据均以(x±s)表示,采用SPSS13.0统计软件包,行方差分析及q检验,P<0.05为差异有统计学意义。
2 实验结果
2.1 一般观察,实验期间对各组大鼠进行一般情况、精神状况等大体观察。对照组大鼠生长良好,除体重自然增长外,无异常改变;模型组大鼠死亡两只,有体重减轻、体毛倒伏、行为异常等反应。昆仙胶囊组无死亡。等的方法
2.2 根据Szapiel[1]等的方法,模型组:7 d时肺泡炎性改变明显,HE染色可见肺间质及肺泡内有大量炎性细胞浸润,以巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞为主,肺泡间隔增宽,伴有水肿和出血。Masson染色见肺泡间隔增宽明显,胶原纤维增多,肺泡结构改变。28 d时,肺泡炎症减轻,但间质内仍有巨噬细胞浸润,成纤维细胞大量聚集,肺泡结构破坏,间隔增宽,并且炎症、纤维化、肺泡出血并见;Masson染色见大量胶原纤维呈束状或者片状沉积,肺泡壁变厚,肺泡结构紊乱。昆仙胶囊组各时间点与博来霉素组比较表现出基本一致的变化规律,但肺泡炎和纤维化和程度较轻。具体积分如下。
2.3 TNF-α细胞因子测定 模型组TNF-α与对照组相比水平升高(P<0.05),昆仙胶囊组TNF-α水平明显低于模型组(P<0.05)。见表2。
3 讨论
肺纤维化是由多种因素引起的难治性肺脏病变,其中自身免疫因素起到重要作用。近年来的研究主要集中在多种与自身相关的细胞因子与肺纤维化的关系。雷公藤药物是临床常用来治疗类风湿关节炎等自身免疫性疾病的中药,近年来研究发现其对肺纤维化具有较好的作用。昆仙胶囊主要成份为昆明山海棠提取物,具有较好的抗炎镇痛及抗自身免疫效果。从上述结果可知,昆仙胶囊在第1周起时具有明显的减轻肺泡炎症的效果,并开发发挥减轻肺纤维化的作用,并在第4周具有较明显的作用。
TNF-α广泛参与到炎症与自身免疫和各个环节,并具有刺激纖维组织增生的作用。静脉注射TNF-α可引起弥漫性肺泡损伤,以肺泡上皮细胞和内皮细胞坏死为主要表现。应用抗TNF-α抗体能使小鼠免于患博莱霉素(BIM)引起的肺间质炎症和纤维化,有学者发现,BIM气管注射后肺组织总TNF-α含量均较对照组明显增加,本实验结果表明,模型组大鼠TNF-α水平均明显增加,虽然其表达水平随着时间延长下降,但仍持续高于空白对照组。而昆仙胶囊治疗组水平与模型组差异有统计学意义,提示抗自身免疫是临床应用免疫抵制药物治疗纤维化的基础,而TNF-α作为自身免疫和炎症环节中重要的细胞因子,可能是自身免疫药物起作用的环节之一。昆仙胶囊可消除炎症递质,减少炎性细胞因子TNF-α的释放,从而达到防止肺纤维化的作用。
参考文献
[1] Szapiel SV,ElsonNA,FulmarJD,et al.Bleorrmjcirrinduced interstial Pulmonary disease in the nude,athymic mouse.Am Rev Respir Dis,1979,120:893-894.