【摘 要】
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目的通过体内过度表达验证z5150基因毒性,利用Red重组系统构建肠出血性大肠杆菌(EHEC)z5150基因缺失突变株并探究其致病力。方法在菌体内过度表达z5150基因,测定细菌生长曲线
【机 构】
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安徽医科大学; 军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室;
【基金项目】
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国家自然科学基金资助项目(81401643);国家重点基础研究发展计划资助项目(2015CB554202)
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目的通过体内过度表达验证z5150基因毒性,利用Red重组系统构建肠出血性大肠杆菌(EHEC)z5150基因缺失突变株并探究其致病力。方法在菌体内过度表达z5150基因,测定细菌生长曲线验证其毒性。应用PCR技术扩增出含有卡那霉素抗性基因的目的基因上下游同源臂片段,电转入含有p KD46质粒的EHEC中,在阿拉伯糖诱导下使打靶片段重组到基因组。卡那霉素基因的两端包含FRT位点,p FLP2质粒可介导FLP位点专一性重组去除抗性标记。经DNA测序验证目的基因缺失后,通过菌株感染HT29细胞和BALB/c雌鼠检测缺失株细胞黏附能力和毒力的改变。结果与结论成功构建EHEC△z5150缺失突变株。z5150的缺失不影响细菌的正常生长,但过度表达后明显抑制细菌生长,发挥毒素效应。与野生株相比,EHEC△z5150缺失突变株对肠上皮细胞黏附能力明显增强;小鼠致死率增高,提示其致病力增强。该研究为EHEC基因功能研究提供了基因敲除技术,证明了Rel E家族z5150参与EHEC细胞黏附,并增强菌株毒力,为进一步研究EHEC致病机制奠定了基础。
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