论文部分内容阅读
【摘要】 甜蜜素的测定因衍生过程步骤多、对条件敏感、每一步骤的细小偏差都会造成结果偏离等因素，影响检测人员的检测。新修订的GB 5009.97-2016中仍把气相色谱法作为测定甜蜜素的第一方法，新标准优化了样品处理、衍生化和测定的条件。本文介绍了气相色谱法测定甜蜜素的检测过程，并结合日常工作的经验指出检测中的一些关键控制点，以供相关检测参考借鉴。
【关键词】 甜蜜素；测定；气相色谱法
【DOI编码】 10.3969/j.issn.1674-4977.2018.03.011
Abstract： The determination of sodium cyclamate is due to many steps，sensitive to conditions and small deviations from each step which will cause the deviation of results and other factors，which affect the detection of the inspectors. The newly revised GB 5009.97-2016 still regards gas chromatography as the first method. Sample processing，derivatization and conditions of determination are all optimized in the new standard. In this paper，the determination process of sodium cyclamate by gas chromatography is introduced，and some key control points in the detection are pointed out，which can be used for reference in similar detection.
Key words： sodium cyclamate；determination；gas chromatography
環己基氨基磺酸钠（又名甜蜜素），CNS号（食品添加剂的中国编码）：19.002；INS号（国际编码）：952。甜蜜素是一种人工合成的甜味剂，被广泛使用在各类食品中，也是各级食品监督管理机构经常监督检测项目，GB 2760-2014中规定了其使用最高限量为0.65～8.0g/kg。新国标GB 5009.97-2016于2017年3月1日实施，其中增加了液相色谱法、液相色谱-质谱/质谱法。白酒、葡萄酒、黄酒、料酒中甜蜜素的测定适用于液相色谱-质谱/质谱法；配制酒中甜蜜素的测定适用于液相色谱法；其他如饮料类、蜜饯凉果、果丹类、话化类、带壳及脱壳熟制坚果与籽类、水果罐头、果酱、糕点、面包、饼干、冷冻饮品、果冻、复合调味料、腌渍的蔬菜、腐乳食品中甜蜜素的测定，用气相色谱法或液相色谱法都可以。
1 仪器与试剂
1.1 仪器
气相色谱仪：岛津GC-2010（配FID 检测器）；电子天平：ML802，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；分析天平：AL204-1C，赛多利斯科学仪器（上海）有限公司；瓶口分液器：BRAND Dispensette，德国BRAND GMBH+CO KG公司；超声波振荡器：KQ-250DB，昆山市超声仪器有限公司；台式高速冷冻离心机：H2050R，长沙湘仪离心机有限公司；移液枪：Finnpipette，美国Thermo Scientific公司。
1.2 试剂
甜蜜素（环己基氨基磺酸钠）标准品（纯度为99.5%）：精确称取0.5612g甜蜜素标准品，用水溶解并定容至100mL混匀，制得环己基氨基磺酸5.00mg/mL储备液，置于1～4℃冰箱，可保存12个月。准确移取20.0mL标准储备液用水定容至100mL，制得环己基氨基磺酸标准使用液（1.00mg/mL）。置于1～4℃冰箱保存，可保存6个月。氯化钠、石油醚、氢氧化钠、硫酸、亚铁氰化钾、硫酸锌、亚硝酸钠均为分析纯，正庚烷为色谱纯。
2 原理
食品中的环己基氨基磺酸钠用水提取，在硫酸介质中环己基氨基磺酸钠与亚硝酸反应，生成环己醇亚硝酸酯。利用气相色谱氢火焰离子化检测器进行分离及分析，保留时间定性，外标法定量。
3 标准溶液系列的制备及衍生化
用移液枪准确移取1.00mg/mL环己基氨基磺酸标准溶液0.10mL、0.20mL、0.50mL、1.00mL、2.00mL，移取5.00mg/mL环己基氨基磺酸标准溶液1.00mL于50mL带盖离心管中，加水定容至10mL。配成标准溶液系列浓度为：0.01mg/mL、0.02mg/mL、0.05mg/mL、0.10mg/mL、0.20mg/mL、0.50mg/mL，临用时配制以备衍生化用。
4 色谱条件
色谱柱：弱极性毛细管柱，RTX-1，30.0m×0.25mm×0.25μm。升温程序：60℃保持2分钟，10℃/分钟升至90℃。进样口：温度200℃，进样量1μL，分流进样，分流比20：1。检测器：氢火焰离子化检测器（FID），温度250℃。载气：高纯氮气，流量37.9mL/min，尾吹，流量30mL/min；氢气，流量47mL/min；空气，流量400mL/min。
5 注意事项
5.1 试样制备
拿到样品首先要判断该食品分类，带壳熟制坚果和籽类与不带壳熟制坚果和籽类，GB 2760-2014上规定的甜蜜素最大使用量是不一样的，制备样品时应注意按客户需求选择带壳还是不带壳。含二氧化碳的液体试样，用超声20min除去二氧化碳，效果显著；低脂、低蛋白固体试样加水超声提取20min或浸泡过夜；高蛋白样品如雪糕、冰淇淋等待其融化后混匀称取，加水超声提取20min后再加沉淀剂沉淀蛋白；高脂样品称取后加水超声提取20min后再加入石油醚，振摇，超声，去除石油醚，重复以上操作数次以去除脂肪。 5.2 衍生
1）样品应先放在冰浴中降温后再加正庚烷（分析纯正庚烷也可以，切记一定要先做试剂空白，因为许多厂家的分析纯试剂有干扰峰）。实验证明，如若不提前在冰浴中放5min，在加入亚硝酸钠溶液和硫酸溶液后，夏天温度比较高时，会生成棕色有刺激性气味的氮氧化物，提前冰浴就会避免这种现象，也能减小有毒性的氮氧化物对实验操作人员的身体危害。2003版国标中提取溶剂是正己烷，有些檢测人员仍习惯使用正己烷。正庚烷、正己烷职业性有害因素的接触限值量值（PC-STEL）分别为1000mg/m3、180mg/m3，说明正庚烷的毒性远小于正己烷，使用正庚烷对保障实验人员的身体健康有积极的作用，而且正庚烷的沸点为98.5℃，高于正己烷的沸点68.7℃，较正己烷挥发性小（详见表1）。正己烷作提取溶剂，不但毒性较正庚烷强，且易挥发，容易造成检测结果偏离。正庚烷与正己烷的化学性质接近，因此用正庚烷替代正己烷作提取溶剂，并且提前加入封住液面，使容易挥发的衍生物环己醇亚硝酸酯溶解在正庚烷中，从而减少了损失。
2）加试剂的顺序应严格按照标准去做，先加亚硝酸钠溶液，摇匀后加硫酸溶液，盖紧离心管盖后再摇匀，这样可以避免局部试剂浓度过高，因为衍生反应通常对反应条件特殊敏感。
3）冰浴的时间要严格控制好。加入亚硝酸钠溶液和硫酸溶液混匀后要尽快置于冰浴中30分钟，期间振摇3次到5次。
4）涡旋的时间、振摇的次数和力度也要尽量一致，因为涡旋或振摇实际就是一个萃取的过程，涡旋的时间和振摇的力道都会影响萃取结果，所以要尽量保证相同的萃取效率。
5）离心分层或静置分层后，要先将上清液混匀后再吸取到进样瓶中。因为衍生反应是一直进行的，上清液中的甜蜜素浓度是不均匀的，靠近无机相的浓度会高于远离端的浓度。
5.3 测定
1）每次测定最好同时进行空白样和质控样的测定。运行空白样品可排除溶剂干扰，质控样品可用以前做过的比对样品，也可以用液相色谱-质谱/质谱法定值的样品，甚至可以用标准曲线上的某一点来做质控样品。质控样品可以添加在序列的前、中、后段。
2）如果试样上清液响应值超出曲线线性范围，那么计算出来的数值就不可用，应用溶剂稀释后再行测定。
3）必须做平行样，GB 5009.97-2016中要求平行测定次数不少于两次，因为甜蜜素检测过程中多变的因素对结果的影响很大。
5.4 结果计算与判定
固体饮料的计算结果按稀释倍数调整，果冻粉的计算结果按冲调倍数调整，问题样品用液相色谱-质谱/质谱法验证。
6 结语
综上所述，在拿到新颁布或新修订的标准后一定要仔细研究每一步骤，多查询相关资料，弄懂反应机理并充分熟悉检验过程，这样在实际操作中才会有的放矢。通过对气相色谱法测定甜蜜素的不确定度评定得出，测量重复性和工作曲线引入的不确定度较大。因此，曲线上每一点标准溶液的量要准确移取，必要时增加标准曲线的点数；样品测定要严格按操作规范进行，才能得到较好的实验数据，提高检测结果的可靠性。
【参考文献】
[1] 食品安全国家标准 食品中环己基氨基磺酸钠的测定：GB 5009.97-2016[S].
[2] 食品安全国家标准 食品添加剂使用标准：GB 2760-2014[S].
[3] 工作场所有害因素职业接触限值 化学有害因素：GBZ 2.1-2007[S].
【关键词】 甜蜜素；测定；气相色谱法
【DOI编码】 10.3969/j.issn.1674-4977.2018.03.011
Abstract： The determination of sodium cyclamate is due to many steps，sensitive to conditions and small deviations from each step which will cause the deviation of results and other factors，which affect the detection of the inspectors. The newly revised GB 5009.97-2016 still regards gas chromatography as the first method. Sample processing，derivatization and conditions of determination are all optimized in the new standard. In this paper，the determination process of sodium cyclamate by gas chromatography is introduced，and some key control points in the detection are pointed out，which can be used for reference in similar detection.
Key words： sodium cyclamate；determination；gas chromatography
環己基氨基磺酸钠（又名甜蜜素），CNS号（食品添加剂的中国编码）：19.002；INS号（国际编码）：952。甜蜜素是一种人工合成的甜味剂，被广泛使用在各类食品中，也是各级食品监督管理机构经常监督检测项目，GB 2760-2014中规定了其使用最高限量为0.65～8.0g/kg。新国标GB 5009.97-2016于2017年3月1日实施，其中增加了液相色谱法、液相色谱-质谱/质谱法。白酒、葡萄酒、黄酒、料酒中甜蜜素的测定适用于液相色谱-质谱/质谱法；配制酒中甜蜜素的测定适用于液相色谱法；其他如饮料类、蜜饯凉果、果丹类、话化类、带壳及脱壳熟制坚果与籽类、水果罐头、果酱、糕点、面包、饼干、冷冻饮品、果冻、复合调味料、腌渍的蔬菜、腐乳食品中甜蜜素的测定，用气相色谱法或液相色谱法都可以。
1 仪器与试剂
1.1 仪器
气相色谱仪：岛津GC-2010（配FID 检测器）；电子天平：ML802，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；分析天平：AL204-1C，赛多利斯科学仪器（上海）有限公司；瓶口分液器：BRAND Dispensette，德国BRAND GMBH+CO KG公司；超声波振荡器：KQ-250DB，昆山市超声仪器有限公司；台式高速冷冻离心机：H2050R，长沙湘仪离心机有限公司；移液枪：Finnpipette，美国Thermo Scientific公司。
1.2 试剂
甜蜜素（环己基氨基磺酸钠）标准品（纯度为99.5%）：精确称取0.5612g甜蜜素标准品，用水溶解并定容至100mL混匀，制得环己基氨基磺酸5.00mg/mL储备液，置于1～4℃冰箱，可保存12个月。准确移取20.0mL标准储备液用水定容至100mL，制得环己基氨基磺酸标准使用液（1.00mg/mL）。置于1～4℃冰箱保存，可保存6个月。氯化钠、石油醚、氢氧化钠、硫酸、亚铁氰化钾、硫酸锌、亚硝酸钠均为分析纯，正庚烷为色谱纯。
2 原理
食品中的环己基氨基磺酸钠用水提取，在硫酸介质中环己基氨基磺酸钠与亚硝酸反应，生成环己醇亚硝酸酯。利用气相色谱氢火焰离子化检测器进行分离及分析，保留时间定性，外标法定量。
3 标准溶液系列的制备及衍生化
用移液枪准确移取1.00mg/mL环己基氨基磺酸标准溶液0.10mL、0.20mL、0.50mL、1.00mL、2.00mL，移取5.00mg/mL环己基氨基磺酸标准溶液1.00mL于50mL带盖离心管中，加水定容至10mL。配成标准溶液系列浓度为：0.01mg/mL、0.02mg/mL、0.05mg/mL、0.10mg/mL、0.20mg/mL、0.50mg/mL，临用时配制以备衍生化用。
4 色谱条件
色谱柱：弱极性毛细管柱，RTX-1，30.0m×0.25mm×0.25μm。升温程序：60℃保持2分钟，10℃/分钟升至90℃。进样口：温度200℃，进样量1μL，分流进样，分流比20：1。检测器：氢火焰离子化检测器（FID），温度250℃。载气：高纯氮气，流量37.9mL/min，尾吹，流量30mL/min；氢气，流量47mL/min；空气，流量400mL/min。
5 注意事项
5.1 试样制备
拿到样品首先要判断该食品分类，带壳熟制坚果和籽类与不带壳熟制坚果和籽类，GB 2760-2014上规定的甜蜜素最大使用量是不一样的，制备样品时应注意按客户需求选择带壳还是不带壳。含二氧化碳的液体试样，用超声20min除去二氧化碳，效果显著；低脂、低蛋白固体试样加水超声提取20min或浸泡过夜；高蛋白样品如雪糕、冰淇淋等待其融化后混匀称取，加水超声提取20min后再加沉淀剂沉淀蛋白；高脂样品称取后加水超声提取20min后再加入石油醚，振摇，超声，去除石油醚，重复以上操作数次以去除脂肪。 5.2 衍生
1）样品应先放在冰浴中降温后再加正庚烷（分析纯正庚烷也可以，切记一定要先做试剂空白，因为许多厂家的分析纯试剂有干扰峰）。实验证明，如若不提前在冰浴中放5min，在加入亚硝酸钠溶液和硫酸溶液后，夏天温度比较高时，会生成棕色有刺激性气味的氮氧化物，提前冰浴就会避免这种现象，也能减小有毒性的氮氧化物对实验操作人员的身体危害。2003版国标中提取溶剂是正己烷，有些檢测人员仍习惯使用正己烷。正庚烷、正己烷职业性有害因素的接触限值量值（PC-STEL）分别为1000mg/m3、180mg/m3，说明正庚烷的毒性远小于正己烷，使用正庚烷对保障实验人员的身体健康有积极的作用，而且正庚烷的沸点为98.5℃，高于正己烷的沸点68.7℃，较正己烷挥发性小（详见表1）。正己烷作提取溶剂，不但毒性较正庚烷强，且易挥发，容易造成检测结果偏离。正庚烷与正己烷的化学性质接近，因此用正庚烷替代正己烷作提取溶剂，并且提前加入封住液面，使容易挥发的衍生物环己醇亚硝酸酯溶解在正庚烷中，从而减少了损失。
2）加试剂的顺序应严格按照标准去做，先加亚硝酸钠溶液，摇匀后加硫酸溶液，盖紧离心管盖后再摇匀，这样可以避免局部试剂浓度过高，因为衍生反应通常对反应条件特殊敏感。
3）冰浴的时间要严格控制好。加入亚硝酸钠溶液和硫酸溶液混匀后要尽快置于冰浴中30分钟，期间振摇3次到5次。
4）涡旋的时间、振摇的次数和力度也要尽量一致，因为涡旋或振摇实际就是一个萃取的过程，涡旋的时间和振摇的力道都会影响萃取结果，所以要尽量保证相同的萃取效率。
5）离心分层或静置分层后，要先将上清液混匀后再吸取到进样瓶中。因为衍生反应是一直进行的，上清液中的甜蜜素浓度是不均匀的，靠近无机相的浓度会高于远离端的浓度。
5.3 测定
1）每次测定最好同时进行空白样和质控样的测定。运行空白样品可排除溶剂干扰，质控样品可用以前做过的比对样品，也可以用液相色谱-质谱/质谱法定值的样品，甚至可以用标准曲线上的某一点来做质控样品。质控样品可以添加在序列的前、中、后段。
2）如果试样上清液响应值超出曲线线性范围，那么计算出来的数值就不可用，应用溶剂稀释后再行测定。
3）必须做平行样，GB 5009.97-2016中要求平行测定次数不少于两次，因为甜蜜素检测过程中多变的因素对结果的影响很大。
5.4 结果计算与判定
固体饮料的计算结果按稀释倍数调整，果冻粉的计算结果按冲调倍数调整，问题样品用液相色谱-质谱/质谱法验证。
6 结语
综上所述，在拿到新颁布或新修订的标准后一定要仔细研究每一步骤，多查询相关资料，弄懂反应机理并充分熟悉检验过程，这样在实际操作中才会有的放矢。通过对气相色谱法测定甜蜜素的不确定度评定得出，测量重复性和工作曲线引入的不确定度较大。因此，曲线上每一点标准溶液的量要准确移取，必要时增加标准曲线的点数；样品测定要严格按操作规范进行，才能得到较好的实验数据，提高检测结果的可靠性。
【参考文献】
[1] 食品安全国家标准 食品中环己基氨基磺酸钠的测定：GB 5009.97-2016[S].
[2] 食品安全国家标准 食品添加剂使用标准：GB 2760-2014[S].
[3] 工作场所有害因素职业接触限值 化学有害因素：GBZ 2.1-2007[S].