目的优化脐带血单个核细胞的分离制备及保存的方法。方法采集符合要求的足月顺产或剖宫产新生儿脐带血,采用二次回浆法分离制备脐带血有核细胞并与传统离心法比较。对分离制备的脐血有核细胞采用不同的降温速率进行低温保存研究,优化降温速率及程序降温终止温度。结果采用二次回浆法和传统离心法分离制备脐带血有核细胞,其总数(×109)分别为1.52±0.89和1.11±0.35,回收率(%)分别为92.12±5.78和86.94±7.34,差异有统计学意义(P<0.05)。脐血造血干细胞在4℃～-40℃降温过程中,采用1℃/min和5℃/min的降温速率,细胞回收率(%)分别为92.4±2.3和84.7±2.4,P<0.05;在-40℃～-90℃时,采用l℃/min或5℃/min的降温速率,细胞回收率(%)分别为91.1±1.9和90.3±2.8,P>0.05。在程序降温仪降至-90℃和-130℃后移至液氮,细胞回收率(%)分别为91.1±2.1和92.3±1.9,P>0.05。结论二次回浆法能提高脐带血制备有核细胞数;脐血干细胞保存优化的方法为4℃～-40℃时采用1℃/min的降温速率,再以5℃/min的降温速率降至-90℃后移入液氮保存。