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摘要 [目的]建立甘薯黑斑病菌快速大量产孢体系，为甘薯黑斑病品种抗性鉴定以及药剂生物测定奠定基础。[方法]采用3种方法制备甘薯黑斑病菌甘薯长喙壳菌（Ceratocystis fimbriata Ellis et Halsted）孢子悬浮液，研究甘薯黑斑病菌快速大量产孢方法。[结果]洗涤PDA和洗涤薯片培养5～ 6 d后镜检孢子悬浮液，一个视野内孢子数分别约为93、95个。利用PS培养液培养1、2、4 d后镜检孢子数分别为 211、136、137个。[结论]采用PS液体培养基在特定培养条件下摇培1 d即可获得大量高浓度孢子悬浮液，极大地缩短了黑斑病菌产孢时间，显著提高了产孢量，且不易污染。
关键词 甘薯黑斑病;孢子悬浮液;制备方法
中图分类号 S435.311文献标识码 A文章编号 0517-6611（2018）34-0127-03
甘薯（Ipomoea batatas Lam.）在我国每年的种植面积约500万hm 占世界甘薯种植面积的50%左右[1]。甘薯黑斑病（sweeppotato black rot）是甘薯栽培和贮藏中的主要病害之一，在世界各甘薯产区均有发生，其病原菌为甘薯长喙壳菌（Ceratocystis fimbriata Ellis et Halsted），该菌分布广泛、种群分化复杂，主要为害幼苗茎基部及块根组织，引起死苗、烂床、烂窖，对甘薯生产影响极大[2]。带有黑斑病菌的病薯中含有甘薯黑疤霉酮等物质，家畜食用后可引起中毒症状[3];用病薯做发酵原料会延缓发酵过程，降低乙醇产量和质量，严重制约甘薯产业的发展。目前，甘薯黑斑病的防治主要是以选育抗病品种及化学杀菌剂防治为主[4-5]。而甘薯抗病育种及药剂筛选都需要大量的孢子悬浮液进行试验。目前主要采用薯片法和黑斑病菌平板洗涤孢子法制备孢子悬浮液，但这2种方法耗时较长。同时，薯片法制备的孢子悬浮液由于无法保证全程无菌操作，不可避免地会被杂菌污染[6];而采用传统的从黑斑病平板中洗涤孢子过滤的方法耗时长效率低，无法快速大量地为药剂筛选和抗药性风险评估等提供试验所需的分生孢子悬浮液。因此，建立一种甘薯黑斑病菌快速大量产孢的技术体系是甘薯黑斑病精准抗病鉴定、甘薯黑斑病药剂生物测定以及抗药性风险评估等研究的重要条件之一。笔者研究甘薯黑斑病菌快速大量产孢方法，旨在建立一种新型的甘薯黑斑病菌快速大量产孢的技术体系。
1 材料与方法
1.1 试验材料
黑斑病菌的分离和纯化：从甘薯窖中采集黑斑病发病薯块，采用组织分离法分离甘薯黑斑病菌。首先清洗薯块表面，然后用自来水流水冲洗约20 min，将带病薯块取出擦干置于超净工作台中，取黑斑病病健交接部位置于75%乙醇中进行表面消毒，再用0.1 %的升汞消毒后，用灭菌水清洗干净后置于马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）平板中培养，经分离纯化以及柯赫氏法则验证确定后保留菌株。该菌株分离并保存于4 ℃冰箱中。
黑斑病菌培养：打取PDA平板中的菌碟，每个三角瓶中接种10 ～ 12个菌碟，将接种好的三角瓶置于30 ℃恒温摇床中120 r/min摇培24 h。
孢子悬浮液制备：将摇培获得的悬浮液用纱布过滤去除菌丝后，镜检测定孢子液浓度，并采用无菌水将孢子悬浮液浓度调节至试验所需即可。
PS培养液的制备：马铃薯20 g加入1 L超纯水煮沸至马铃薯完全烂软，纱布过滤后加入15 g蔗糖，加超纯水定容至1 L，每个三角瓶分装30 mL，然后置于121 ℃高压灭菌15 min备用。
1.2 试验方法
1.2.1 甘薯黑斑病菌最佳产孢方法筛选。采用PDA平板接种活化后的黑斑病菌菌碟，将接种好的平板置于25 ℃恒温培养箱中培养5～ 6 d，采用30 mL无菌水洗涤平板表面孢子，纱布过滤去除菌丝后，测量孢子悬浮液中目镜10倍及物镜20倍显微镜下一个视野内孢子数，设置3个重复，每个重复制片3张。该方法设为对照组①。
选择大小适中、无病虫害侵染的薯块洗净自然晾干后，采用75 %乙醇表面消毒后晾干，切成厚约1 cm的薯片，把切好的薯片放入配好的孢子悬浮液内浸一下，取出薯片晾干表面水分，再放入无菌培养皿内培养，期间采用纸巾或棉花团保湿纸，将接种的薯块置于25 ℃恒温培养箱中培养5～6 d，薯片表面长满浅灰色的分生孢子，用30 mL无菌水冲洗，纱布过滤去除菌丝后，测量孢子悬浮液中目镜10倍及物镜20倍显微镜下一个视野内孢子数，设置3个重复，每个重复制片3张。该方法设为对照组②。
采用马铃薯20 g加入1 L超纯水煮沸至马铃薯完全烂软，纱布过滤后加入15 g蔗糖，用超纯水将培养液补足至1 L，每个三角瓶分装30 mL，然后121 ℃高压灭菌15 min备用。打取PDA平板中的菌碟，每个三角瓶中接种10～12个菌碟，将接种好的三角瓶置于30 ℃恒温摇床中120 r/min摇培，1 d后取出，测量孢子悬浮液中目镜10倍及物镜20倍显微镜下一个视野的孢子数。该方法为PS液体培养法。
1.2.2 不同培养时间PS液体培养法产孢量测定。采用上述PS液體培养法，培养甘薯黑斑病菌。每1、2、3、4 d取出3瓶培养液，每瓶培养液制片3张，测量孢子悬浮液中目镜10倍及物镜20倍显微镜下一个视野的孢子数，不同培养条件下的产孢数。以上述对照组①和对照组②方法培养5～6 d作为处理对照。
2 结果与分析
2.1 最佳产孢方法筛选
由图1可知，培养5～ 6 d后孢子悬浮液中目镜10倍及物镜20倍显微镜下一个视野内孢子数约为93个。由图2可知，培养5～ 6 d后镜检孢子数约为95个，且该方法存在杂菌污染的可能性。PS液体培养法见图3。由图3可知，培养1 d后镜检孢子数为211个。
2.2 不同培养时间PS液体培养法产孢量 由图4可知，使用PS液体培养基在特定培养条件下摇培1 d，在放大200倍显微镜下每个视野均可观察到211个孢子，与采用对照①和对照②培养5～6 d制备的孢子悬浮液制备方法下平均每个视野可观察到的孢子数93和95差异极显著;同时，对比采用PS液体培养基摇培0、1、2和4 d所制备的孢子悬浮液，发现摇培2和4 d后获得的孢子悬浮液在同样放大倍数的显微镜下平均每个视野观察到的孢子数分别为136和137，方差分析结果表明，PS液体培养基摇培2和4 d比摇培1 d所得到的孢子悬浮液中平均每个视野的孢子数211显著降低，从图5可以看出，培养4 d黑斑病菌孢子已有部分开始消解。
3 结论与讨论
甘薯黑斑病菌侵染薯块后会形成黑色凹陷病斑，并在病斑及周围产生有毒物质，是造成甘薯烂窖的主要原因之一[7-8]。因此，建立甘薯黑斑病菌快速大量产孢的技术体系是甘薯黑斑病精准抗病鉴定、甘薯黑斑病药剂生物测定以及抗药性风险评估等研究的基础之一。该研究通过对比3种甘薯黑斑病产孢方法，建立一种新型的甘薯黑斑病产孢体系。该试验采用的PS液体培养基在特定培养条件下摇培1 d即可获得大量高浓度孢子悬浮液，极大地缩短了黑斑病菌产孢时间，显著提高了产孢量;同时由于培养期间全程无菌操作条件简易可控，因此病原菌不易被污染，可以有效避免薯片法产孢培养的薯片腐烂、杂菌多、时间长等引起孢子液不纯，使甘薯黑斑病抗性鉴定和甘薯黑斑病药剂生物测定试验更为精准高效。
参考文献
[1]马代夫，李洪民，唐君，等.中国甘薯产业的发展现状与发展趋势[C]//马代夫.甘薯与粮食能源安全——中国徐州第四届国际甘薯学术讨论会暨第四届中日韩甘薯学术讨论会论文集.北京：中国农业大学出版社，2010：3-10.
[2]HALSTED B D.Some fungous diseases of the sweet potato：The black rot [J].New Jersey agriculture experiment station bulletin， 1890，76：7-14.
[3]孙厚俊，刘美艳，宗玮玮，等.黑斑病对甘薯体内几种保护酶活性的影响[J].广西农学报，201 26（3）：14-16.
[4]谢一芝，邱瑞镰，戴起伟，等.甘薯抗黑斑病育种研究进展[J].杂粮作物，1997（2）：22-24.
[5]谢一芝，尹晴红，戴起伟，等.甘薯品种抗黑斑病鉴定及其遗传趋势[J].植物遗传资源学报，2003，4（4）：311-313.
[6]张德胜，张永超，乔奇，等.10种殺菌剂对甘薯黑斑病的毒力及联合毒力[J].农药，201 51（6）：452-454.
[7]贾赵东，郭小丁，尹晴红，等.甘薯黑斑病的研究现状与展望[J].江苏农业科学，2011（1）：144-147.
[8]王硕.甘薯ACE抑制肽的制备及其降血压活性研究[D].北京：中国农业科学院，2011.
关键词 甘薯黑斑病;孢子悬浮液;制备方法
中图分类号 S435.311文献标识码 A文章编号 0517-6611（2018）34-0127-03
甘薯（Ipomoea batatas Lam.）在我国每年的种植面积约500万hm 占世界甘薯种植面积的50%左右[1]。甘薯黑斑病（sweeppotato black rot）是甘薯栽培和贮藏中的主要病害之一，在世界各甘薯产区均有发生，其病原菌为甘薯长喙壳菌（Ceratocystis fimbriata Ellis et Halsted），该菌分布广泛、种群分化复杂，主要为害幼苗茎基部及块根组织，引起死苗、烂床、烂窖，对甘薯生产影响极大[2]。带有黑斑病菌的病薯中含有甘薯黑疤霉酮等物质，家畜食用后可引起中毒症状[3];用病薯做发酵原料会延缓发酵过程，降低乙醇产量和质量，严重制约甘薯产业的发展。目前，甘薯黑斑病的防治主要是以选育抗病品种及化学杀菌剂防治为主[4-5]。而甘薯抗病育种及药剂筛选都需要大量的孢子悬浮液进行试验。目前主要采用薯片法和黑斑病菌平板洗涤孢子法制备孢子悬浮液，但这2种方法耗时较长。同时，薯片法制备的孢子悬浮液由于无法保证全程无菌操作，不可避免地会被杂菌污染[6];而采用传统的从黑斑病平板中洗涤孢子过滤的方法耗时长效率低，无法快速大量地为药剂筛选和抗药性风险评估等提供试验所需的分生孢子悬浮液。因此，建立一种甘薯黑斑病菌快速大量产孢的技术体系是甘薯黑斑病精准抗病鉴定、甘薯黑斑病药剂生物测定以及抗药性风险评估等研究的重要条件之一。笔者研究甘薯黑斑病菌快速大量产孢方法，旨在建立一种新型的甘薯黑斑病菌快速大量产孢的技术体系。
1 材料与方法
1.1 试验材料
黑斑病菌的分离和纯化：从甘薯窖中采集黑斑病发病薯块，采用组织分离法分离甘薯黑斑病菌。首先清洗薯块表面，然后用自来水流水冲洗约20 min，将带病薯块取出擦干置于超净工作台中，取黑斑病病健交接部位置于75%乙醇中进行表面消毒，再用0.1 %的升汞消毒后，用灭菌水清洗干净后置于马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）平板中培养，经分离纯化以及柯赫氏法则验证确定后保留菌株。该菌株分离并保存于4 ℃冰箱中。
黑斑病菌培养：打取PDA平板中的菌碟，每个三角瓶中接种10 ～ 12个菌碟，将接种好的三角瓶置于30 ℃恒温摇床中120 r/min摇培24 h。
孢子悬浮液制备：将摇培获得的悬浮液用纱布过滤去除菌丝后，镜检测定孢子液浓度，并采用无菌水将孢子悬浮液浓度调节至试验所需即可。
PS培养液的制备：马铃薯20 g加入1 L超纯水煮沸至马铃薯完全烂软，纱布过滤后加入15 g蔗糖，加超纯水定容至1 L，每个三角瓶分装30 mL，然后置于121 ℃高压灭菌15 min备用。
1.2 试验方法
1.2.1 甘薯黑斑病菌最佳产孢方法筛选。采用PDA平板接种活化后的黑斑病菌菌碟，将接种好的平板置于25 ℃恒温培养箱中培养5～ 6 d，采用30 mL无菌水洗涤平板表面孢子，纱布过滤去除菌丝后，测量孢子悬浮液中目镜10倍及物镜20倍显微镜下一个视野内孢子数，设置3个重复，每个重复制片3张。该方法设为对照组①。
选择大小适中、无病虫害侵染的薯块洗净自然晾干后，采用75 %乙醇表面消毒后晾干，切成厚约1 cm的薯片，把切好的薯片放入配好的孢子悬浮液内浸一下，取出薯片晾干表面水分，再放入无菌培养皿内培养，期间采用纸巾或棉花团保湿纸，将接种的薯块置于25 ℃恒温培养箱中培养5～6 d，薯片表面长满浅灰色的分生孢子，用30 mL无菌水冲洗，纱布过滤去除菌丝后，测量孢子悬浮液中目镜10倍及物镜20倍显微镜下一个视野内孢子数，设置3个重复，每个重复制片3张。该方法设为对照组②。
采用马铃薯20 g加入1 L超纯水煮沸至马铃薯完全烂软，纱布过滤后加入15 g蔗糖，用超纯水将培养液补足至1 L，每个三角瓶分装30 mL，然后121 ℃高压灭菌15 min备用。打取PDA平板中的菌碟，每个三角瓶中接种10～12个菌碟，将接种好的三角瓶置于30 ℃恒温摇床中120 r/min摇培，1 d后取出，测量孢子悬浮液中目镜10倍及物镜20倍显微镜下一个视野的孢子数。该方法为PS液体培养法。
1.2.2 不同培养时间PS液体培养法产孢量测定。采用上述PS液體培养法，培养甘薯黑斑病菌。每1、2、3、4 d取出3瓶培养液，每瓶培养液制片3张，测量孢子悬浮液中目镜10倍及物镜20倍显微镜下一个视野的孢子数，不同培养条件下的产孢数。以上述对照组①和对照组②方法培养5～6 d作为处理对照。
2 结果与分析
2.1 最佳产孢方法筛选
由图1可知，培养5～ 6 d后孢子悬浮液中目镜10倍及物镜20倍显微镜下一个视野内孢子数约为93个。由图2可知，培养5～ 6 d后镜检孢子数约为95个，且该方法存在杂菌污染的可能性。PS液体培养法见图3。由图3可知，培养1 d后镜检孢子数为211个。
2.2 不同培养时间PS液体培养法产孢量 由图4可知，使用PS液体培养基在特定培养条件下摇培1 d，在放大200倍显微镜下每个视野均可观察到211个孢子，与采用对照①和对照②培养5～6 d制备的孢子悬浮液制备方法下平均每个视野可观察到的孢子数93和95差异极显著;同时，对比采用PS液体培养基摇培0、1、2和4 d所制备的孢子悬浮液，发现摇培2和4 d后获得的孢子悬浮液在同样放大倍数的显微镜下平均每个视野观察到的孢子数分别为136和137，方差分析结果表明，PS液体培养基摇培2和4 d比摇培1 d所得到的孢子悬浮液中平均每个视野的孢子数211显著降低，从图5可以看出，培养4 d黑斑病菌孢子已有部分开始消解。
3 结论与讨论
甘薯黑斑病菌侵染薯块后会形成黑色凹陷病斑，并在病斑及周围产生有毒物质，是造成甘薯烂窖的主要原因之一[7-8]。因此，建立甘薯黑斑病菌快速大量产孢的技术体系是甘薯黑斑病精准抗病鉴定、甘薯黑斑病药剂生物测定以及抗药性风险评估等研究的基础之一。该研究通过对比3种甘薯黑斑病产孢方法，建立一种新型的甘薯黑斑病产孢体系。该试验采用的PS液体培养基在特定培养条件下摇培1 d即可获得大量高浓度孢子悬浮液，极大地缩短了黑斑病菌产孢时间，显著提高了产孢量;同时由于培养期间全程无菌操作条件简易可控，因此病原菌不易被污染，可以有效避免薯片法产孢培养的薯片腐烂、杂菌多、时间长等引起孢子液不纯，使甘薯黑斑病抗性鉴定和甘薯黑斑病药剂生物测定试验更为精准高效。
参考文献
[1]马代夫，李洪民，唐君，等.中国甘薯产业的发展现状与发展趋势[C]//马代夫.甘薯与粮食能源安全——中国徐州第四届国际甘薯学术讨论会暨第四届中日韩甘薯学术讨论会论文集.北京：中国农业大学出版社，2010：3-10.
[2]HALSTED B D.Some fungous diseases of the sweet potato：The black rot [J].New Jersey agriculture experiment station bulletin， 1890，76：7-14.
[3]孙厚俊，刘美艳，宗玮玮，等.黑斑病对甘薯体内几种保护酶活性的影响[J].广西农学报，201 26（3）：14-16.
[4]谢一芝，邱瑞镰，戴起伟，等.甘薯抗黑斑病育种研究进展[J].杂粮作物，1997（2）：22-24.
[5]谢一芝，尹晴红，戴起伟，等.甘薯品种抗黑斑病鉴定及其遗传趋势[J].植物遗传资源学报，2003，4（4）：311-313.
[6]张德胜，张永超，乔奇，等.10种殺菌剂对甘薯黑斑病的毒力及联合毒力[J].农药，201 51（6）：452-454.
[7]贾赵东，郭小丁，尹晴红，等.甘薯黑斑病的研究现状与展望[J].江苏农业科学，2011（1）：144-147.
[8]王硕.甘薯ACE抑制肽的制备及其降血压活性研究[D].北京：中国农业科学院，2011.