【摘 要】
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目的:研究miRNA的敲除对全反式维甲酸(ATRA)介导的急性早幼粒细胞白血病髓系分化的影响,并鉴定具有诱导分化功能的miRNA.方法:首先应用miRNA测序技术分析ATRA作用后miRNA的变
【机 构】
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福建医科大学附属协和医院血液科,福建省血液病研究所,福建省血液病重点实验室,福建福州350001;美国City of Hope贝克曼研究所分子与细胞生物学系,加州Duarte 91010
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目的:研究miRNA的敲除对全反式维甲酸(ATRA)介导的急性早幼粒细胞白血病髓系分化的影响,并鉴定具有诱导分化功能的miRNA.方法:首先应用miRNA测序技术分析ATRA作用后miRNA的变化水平.选取上调和下调的miRNA若干,设计合成针对miRNA前体基因序列的sgRNA,通过CRISPR/Cas9技术实现miRNA在编码基因水平上的敲除.实时荧光定量PCR验证miRNA水平的变化和流式细胞术检测miRNA敲除后对细胞分化水平的影响.结果:共有410种成熟miRNA被检出在NB4中表达,在变化超过2倍的miRNA中有74种成熟miRNA表达上调,55种成熟miRNA下调.应用CRISPR/Cas9进行基因敲除后,PCR及Surveyor assay检测可见明显的DNA剪切条带,RT-PCR检测结果显示,miRNA表达水平明显下调,这说明,基因编辑成功抑制了成熟miRNA的表达.敲除miR-223后,细胞的髓系分化受到明显抑制,而敲除miR-155后髓系分化水平则有所上调.结论:应用CRISPR/Cas9可进行针对基因组的有效剪切,从而实现miRNA编码基因的敲除.miR-223和miR-155等部分miRNA敲除可实现对细胞分化水平的影响,其具体机制是通过对分化相关靶基因的综合调控.
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