【摘 要】
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目的·利用负染电镜技术分析人源核小体重塑及组蛋白去乙酰化酶复合物（nucleosome remodeling and deacetylase complex,NuRD复合物）结构，获得人源NuRD复合物的轮廓信息。方法·将C端带有3×Flag标签的MBD3 （methyl-CpG binding domain protein 3）和N端带有10×His标签的GATAD2A （GATA zinc f
【机 构】
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上海交通大学医学院附属第九人民医院上海精准医学研究院
【基金项目】
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国家自然科学基金（32022036）～～；
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目的·利用负染电镜技术分析人源核小体重塑及组蛋白去乙酰化酶复合物（nucleosome remodeling and deacetylase complex,NuRD复合物）结构，获得人源NuRD复合物的轮廓信息。方法·将C端带有3×Flag标签的MBD3 （methyl-CpG binding domain protein 3）和N端带有10×His标签的GATAD2A （GATA zinc finger domain containing 2A）克隆至pMLink表达载体中，采用聚乙烯亚胺瞬时转染过表达的方式在人源Expi293F悬浮细胞里表达NuRD复合物中的蛋白质组分；依次通过Ni-NTA亲和层析、Flag （DYKDDDDK）标签亲和层析和Superose 6 Increase 5/150凝胶过滤层析分离纯化NuRD复合物；利用蛋白质印迹法（Western blotting）和液相色谱-串联质谱法（liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS）对复合物进行组分鉴定；利用负染电镜技术结合单颗粒重构技术研究NuRD复合物的空间结构；通过UCSF Chimera软件将蛋白质数据库（Protein Data Bank,PDB）中已有亚复合物的原子结构模型（7AO9,5FXY）与生成的结构模型进行自动匹配及比对，预测多个蛋白组分在负染结构模型中的定位。结果·利用两步亲和层析，成功富集了带有纯化标签的MBD3、GATAD2A蛋白及其他内源蛋白组分，通过进一步的凝胶过滤层析分离得到了均一性良好的复合物；通过Western blotting和LC-MS/MS鉴定，确认纯化得到的复合物为组分完整的人源NuRD复合物。利用负染电镜技术及单颗粒重构技术初步解析了NuRD复合物的空间结构，其整体轮廓特征明显，呈现为不对称的长条形；通过进一步的三维优化处理，最终获得了人源NuRD复合物分辨率约为17?（1?=0.1 nm）的初步三维结构模型；已有的亚复合物原子结构模型（PDB:7AO9,5FXY）与NuRD复合物的初步三维结构模型自动匹配后，初步确定了MTA1/2/3 （metastasis-associated protein 1/2/3）、 HDAC1/2 （histone deacetylase 1/2）、 RBBP4/7 （retinoblastoma-binding protein 4/7）及MBD2/3 （methyl-CpG-binding domain protein 2/3）蛋白亚基在NuRD复合物负染结构模型中的定位。结论·利用单颗粒重构技术搭建了人源NuRD复合物的低分辨率负染结构模型。
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